抗新型冠状病毒卵黄抗体对病毒及变异株的体外中和作用

目的 研究抗新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin，IgY）在体外对SARS-CoV-2及其变异株的中和抑制作用，探讨其作为鼻腔/口腔喷雾剂用于预防和阻断SARS-CoV-2感染的可能性。方法 采用间接ELISA检测抗SARS-CoV-2 IgY原液及成品对刺突（spike，S）蛋白的抗体效价；用微量细胞病变法检测其对SARS-CoV-2的中和活性；用萤光素酶发光法检测其对SARS-CoV-2假病毒的中和作用。结果 抗SARS-CoV-2 IgY原液的抗S抗原效价为1:32 000~1:64 000，成品的效价为1:16 000~1:32 000；两批原液对活病毒的中和效价分别为1:128和1:256，相应的抑制中浓度（median inhibitory concentration，IC₅₀）分别为36.22和36.50 μg/ml；成品对SARS-CoV-2假病毒的IC₅₀均值分别为4.571 μg/ml（WT）和6.07 μg/ml（D614G）；对变异株假病毒的IC₅₀分别为15.09~29.94 μg/ml（B.1.1.7）、41.71~55.56 μg/ml（B.1.351）和16.66~32.33 μg/ml（B.1.617.2）。结论 抗SARS-CoV-2 IgY与SARS-CoV-2重组S蛋白具有良好的结合活性，在体外能显著地中和SARS-CoV-2活病毒、假病毒及变异株假病毒，有望用于SARS-CoV-2感染的预防和阻断。     

喷雾式添加氨水对氢氧化铝佐剂质量一致性的影响

目的  通过喷雾式添加氨水制备氢氧化铝佐剂,分析其对佐剂质量批间一致性的影响。 方法  分别以喷雾和流加方式添加氨水至三氯化铝溶液各制备3批氢氧化铝佐剂,比较两种氨水添加工艺制备的佐剂粒径、pH、外观等质量指标。 结果  喷雾方式添加氨水制备的3批佐剂平均粒径为（96.7±8.6） nm,pH为4.93±0.02,透析后沉淀量为（20.9±0.4） g/L;流加方式添加氨水制备的3批佐剂平均粒径为（161.0±24.7） nm,pH为4.85±0.06,透析后沉淀量为（105.6±13.8） g/L。相较于流加,以喷雾式添加氨水制备的3批佐剂为均一的乳白色悬液,粒径更小,透析后透析袋底部大颗粒沉淀明显减少,批间一致性更好。 结论  采用喷雾方式将氨水加入三氯化铝溶液中,可使氨水与三氯化铝溶液接触更加充分,产物更加均匀,有助于提高氢氧化铝佐剂外观、粒径、pH等质量指标的批间一致性。     

重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的  在毕赤酵母细胞中稳定表达经连接肽连接的HBsAg和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白（glycoprotein,g）E的重组蛋白,并进行初步纯化及颗粒性验证。方法  构建HBsAg-gE的四拷贝重组表达质粒,经酶切线性化后电转化至毕赤酵母KM71细胞中,甲醇诱导表达。采用免疫印迹法和ELISA检测表达的重组蛋白,经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析初步纯化后进行透射电子显微镜观察。结果  HBsAg-gE四拷贝重组质粒经双酶切鉴定正确。表达的重组蛋白经免疫印迹法检测,可以与小鼠抗gE单克隆抗体及抗HBsAg多克隆抗体特异性结合,相对分子质量约90 000。经ELISA检测HBsAg呈阳性。蔗糖密度梯度离心后,重组蛋白聚集在40%至55%区带之间,在透射电子显微镜下观察到直径约20 nm左右的病毒样颗粒结构。结论  成功在毕赤酵母中表达了HBsAg-gE病毒样颗粒,为在酵母系统中表达水痘-带状疱疹重组疫苗奠定了基础。     

重组四价人乳头瘤病毒16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗制剂工艺的优化

目的 考察不同制剂工艺流程下制备的重组四价人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗的抗原吸附效果、稳定性及免疫原性,根据实验结果筛选出最合适的制剂配方及工艺。方法  通过改变重组四价HPV疫苗的缓冲体系,以及氢氧化铝佐剂的含量、混合工艺、吸附方式与吸附条件,配制不同的实验疫苗,观察其外观,并分别进行蛋白质稳定性、抗原吸附率和小鼠体内半数有效剂量的检测。 结果 重组四价HPV疫苗原液与450 μg/ml氢氧化铝佐剂在pH6.5的组氨酸缓冲体系下混合后的实验疫苗,外观均一性良好,抗原蛋白稳定性最高,Tm=87.4 ℃,小鼠体内免疫原性较好;搅动吸附条件下的4型别HPV抗原吸附率明显高于静止吸附;铝佐剂和抗原蛋白的吸附与混合先后顺序,不同吸附比例、温度和时间对疫苗外观无显著影响,抗原吸附率均大于99.00%。结论 确定了重组四价HPV16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗合适的制剂工艺条件。     

重组毕赤酵母HBsAg诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的   研究毕赤酵母表达的重组HBsAg(Pichia-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.   方法  以rHBsAg免疫雌性BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,并在体外以抗原/特异性多肽刺激.采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定CTL频数.   结果 由毕赤酵母表达的rHBsAg可在小鼠中诱导Th1和Th2型免疫应答;加铝佐剂的rHBsAg诱导IFN-γ的水平及CTL克隆明显高于无佐剂抗原;Pichia-rHBsAg刺激小鼠细胞免疫应答的水平强于酵母-rHBsAg,与中国仓鼠卵巢细胞-rHBsAg相仿.   结论   Pichia-rHBsAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的细胞免疫应答.     

兔抗肠道病毒71型血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响

目的 研究兔抗肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响。方法 将9只实验兔简单随机分为3组,每组3只。5、50和100 μg 3个剂量EV71灭活疫苗和弗氏佐剂均匀混合后,通过肌内注射途径分别免疫3组动物,于第0、7、14及28天各免疫1次,每7天采血,分离血清,检测抗EV71中和抗体效价。结果 100 μg剂量组兔血清抗体效价显著高于5和50 μg剂量组（第42天t值分别为–3.282和–2.486,P值均<0.05）。第42天时,兔血清抗体效价和免疫剂量（5~100 μg范围内）呈线性关系,回归方程y=478.229x–2 041.820。结论 在本实验选择的3个免疫剂量中,随着免疫剂量升高,产生的血清抗体效价也升高,且呈线性关系。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白优化治疗活动期类风湿关节炎的研究

目的： 通过对比重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）不同时间给药联合甲氨蝶呤（MTX）治疗活动性类风湿关节炎的临床疗效,探索重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白最佳治疗时间。方法： 2015年1月至2017年12月收治的活动性类风湿关节炎患者90例随机分为重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白上午治疗组和重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白下午治疗组,各45例。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白上午治疗组给予基础药物（MTX）与上午（8：00~10：00）重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗,重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白下午治疗组给予基础药物（MTX）与下午（16：00~18：00）重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗,均治疗12周。比较治疗前后临床症状、实验室参数的变化情况及不良反应发生情况。结果： 治疗后2组患者的压痛关节数（TJC）、肿胀关节数（SJC）、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、基于28个关节的疾病活动指数（DAS28-ESR）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（ACPA）、血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）水平均较治疗前显著降低（P<0.05）,且重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白下午治疗组患者的TJC、SJC、ESR、DAS28-ESR、ACPA及血清IL-6水平显著低于重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白上午治疗组（P<0.05）;2组患者不良反应总体发生率相似（P>0.05）。结论： 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白下午（16：00~18：00）给药联合甲氨蝶呤治疗活动性类风湿关节炎的疗效可能优于重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白上午（8：00~10：00）给药联合甲氨蝶呤,需进一步研究。     

SARS疫苗研究进展

目前急需开发安全有效的疫苗来预防SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)引起的感染.SARS-CoV灭活疫苗因易于生产可能首先用于临床;但安全性是主要问题.SARS-CoV纤突(S)蛋白是中和抗体的主要诱导物.S蛋白S1亚单位中的受体结合区(RBD)含有多个构象中和表位.这表明含RBD的重组蛋白和编码RBD序列的载体能用于研制安全有效的SARS疫苗.     

金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性测定方法优化及初步应用

 目的  优化金黄色葡萄球菌α-毒素（α-toxin,AT）溶血活性测定方法,用于无毒突变AT（non-toxic mutant AT,mAT）特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。方法  使用AT裂解兔红细胞,释放血红蛋白,通过分光光度法检测溶血活性,并对该方法中的孵育时间、兔红细胞终浓度、Triton X-100浓度进行优化,同时验证方法重复性。对mAT特异性血清抗体进行体外功能性评价,绘制AT溶血曲线,计算AT 溶血率50% 时的浓度,检测血清半数中和抗体滴度。结果  AT溶血活性最适检测条件为：孵育时间90 min,兔红细胞终浓度为2%（V/V）,Triton X-100浓度为0.25%。此条件下,分别加入mAT和含mAT的多价抗原血清抗体,对AT溶血活性均起到明显的抑制作用。AT 溶血率50%时浓度为1.75 μg/ml,变异系数3.75%。mAT和含mAT的多价抗原血清抗体的半数中和抗体滴度初步结果均为1∶64。结论  优化的AT溶血活性检测方法重复性良好,且检测时间较短,可用于特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。     

禽流感H5N1灭活疫苗与不同纳米化佐剂联合免疫研究

目的 观察禽流感H5N1灭活疫苗加不同佐剂以及纳米化佐剂免疫小鼠后产生的免疫应答的差异,同时观察免疫对异亚型病毒攻击后的保护情况.   方法 用H5N1灭活疫苗分别联合佐剂氢氧化铝、纳米化氢氧化铝、MF59和纳米化MF59通过腹腔注射方式免疫雌性BALB/c小鼠,同时分别以H5N1灭活疫苗免疫小鼠以及PBS腹腔注射处理小鼠作对照.采用ELISA方法分别对各组小鼠免疫后血清特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a水平进行检测,以PR8病毒鼻腔攻击后观察小鼠体重变化情况和生存率.采用t检验作组间比较.    结果 与PBS处理组相比,无论以何种方式免疫H5N1疫苗,免疫后特异性IgG及其亚类水平均明显升高(t=7.4004,P<0.01),以联合MF59后诱导的特异性抗体水平最高.其中疫苗单独免疫组和联合M59免疫组IgG2a水平升高明显,联合纳米化MF59免疫小鼠后IgG2a水平有所下降,IgG1水平有所升高;联合铝佐剂组以IgG1升高为主.攻毒后各组小鼠体重均出现下降,但疫苗单独免疫小鼠以及疫苗与佐剂联合免疫小鼠于攻毒后期体重恢复接近正常或者正常.PBS处理组小鼠攻毒后全部死亡,佐剂联合免疫组小鼠存活率100%,而疫苗单独免疫小鼠存活率为70%.   结论 H5N1疫苗无论是单独免疫或是联合不同佐剂免疫均可诱导较高水平的特异性抗体产生,有非常好的免疫原性.H5N1灭活疫苗诱导的抗体亚类以IgG2a为主,MF59以及纳米化MF59也以诱导IgG2a亚类为主,但纳米化MF59可诱导更均衡的免疫应答.联合铝佐剂或纳米化铝佐剂免疫小鼠后均可诱导以IgG1亚类为主的抗体应答.联合两种佐剂均可对小鼠产生很好的异亚型保护.     

人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗在小鼠中的免疫原性研究

 目的   比较人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗在小鼠中的免疫原性,为该疫苗的类型选择提供初步依据。 方法   采用相同血凝素含量（5 μg）的H7N9全病毒灭活和裂解疫苗（含或不含氢氧化铝佐剂共4种类型）,分别对BALB/c小鼠进行1针或2针免疫。免疫后,用血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）试验检测血清抗体滴度,比较不同类型疫苗的免疫效果。 结果   小鼠免疫1针全病毒灭活疫苗后,全部血清阳转,HI抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）为149;免疫2针后,抗体GMT为243。小鼠免疫1针裂解疫苗后无抗体阳转;免疫2针后全部抗体阳转,GMT为139。两种疫苗添加铝佐剂后,诱导的HI抗体GMT仅略有增加。 结论   H7N9全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性较强。在同样类型和剂量的情况下,裂解疫苗需要免疫两次才能达到与全病毒疫苗相同的效果。铝佐剂对免疫原性提升不明显。     

Immunological properties of isepamicin (HAPA-B)

Immunological properties of isepamicin (HAPA-B), a new semisynthetic aminoglycoside, were compared with those of gentamicin (GM). The results are summarized as follows. Rabbits were immunized by HAPA-B or GM with a strong adjuvant, Freund's complete adjuvant, and specific IgG antibodies were found in sera when assayed using PHA and PCA reactions. In sera from guinea pigs and mice immunized by HAPA-B or GM with aluminum hydroxide gel, no specific IgG nor IgE antibody was detected when assayed using PCA reactions. Specific antibodies (IgG, IgE) produced against HAPA-B and GM were confirmed in different animals immunized by chemically introduced antigens of HAPA-B-carrier protein conjugate and GM-carrier protein conjugate, respectively. Guinea pigs immunized by HAPA-B or HAPA-B-carrier protein conjugate with aluminum hydroxide gel did not exhibit typical systemic anaphylactic reactions when elicited with HAPA-B alone. HAPA-B had some immunocross-reactivity with GM. These results suggested that the antibody-producing activity of HAPA-B was similar to that of GM.     

表达甲型H1N1流感病毒血凝素抗原的DNA疫苗构建及其免疫原性评价

目的 构建表达甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)抗原的DNA疫苗,并在小鼠中测试其免疫原性.方法 运用人密码子优化技术合成甲型H1N1流感病毒HA序列,并转移至DNA疫苗载体,用Western blotting检测其表达效率.采用单纯随机抽样方法把BALB/c小鼠分成DNA疫苗组和对照组.用...     

幽门螺杆菌黏附素基因（hpaA）的表达及重组蛋白的免疫原性检测

 目的   研究幽门螺杆菌黏附素 A（adhesin A of Helicobacter pylori,HpaA）基因在大肠杆菌中的表达和检测纯化 HpaA 的免疫原性。方法   将hpaA/pET28a表达质粒转入大肠杆菌BL21（RP）株并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,通过Ni²⁺亲和层析和分子筛层析纯化表达蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达蛋白的相对分子质量,用蛋白质印迹法对表达蛋白进行特性确认。将纯化HpaA腹腔注射Balb/c小鼠,并检测小鼠的抗体水平。结果   表达蛋白的相对分子质量约为30 000,与HpaA相符。纯化的表达蛋白可与抗HpaA抗体发生特异性反应。腹腔注射HpaA的小鼠与对照小鼠间的血清抗HpaA IgG抗体水平差异存在统计学意义（t=8.367,P<0.01）。结论   HpaA在大肠杆菌BL21（RP）株中得到成功表达,且纯化HpaA具有较好的免疫原性。     

Immunogenicity and protective efficacy of a recombinant fusion protein containing the domain III of the dengue 1 envelope protein in non-human primates

Recombinant fusion proteins containing the aa 286-426 of the dengue envelope protein fused to P64k protein from Neisseria meningitidis have been previously reported. Particularly, the immunogenicity and protective capacity of the dengue 2 recombinant protein was demonstrated in Macaca fascicularis monkeys. Here we evaluate the recombinant fusion protein containing the domain III of the dengue 1 envelope protein (PD10) in non-human primates (M. fascicularis and rhesus monkeys) and compare the effect of aluminum hydroxide and Freund adjuvant on the immunity induced. The PD10 protein emulsified in Freund adjuvant was highly immunogenic in M. fascicularis and rhesus monkeys. Following dengue 1 virus challenge, animals immunized with PD10 in Freund adjuvant were protected from viremia. However, monkeys receiving PD10 in aluminum hydroxide developed a poor antibody response and were not protected from viral challenge. These preliminary experiments are encouraging. Other formulations or vaccine schedules are being studied in an attempt to find regimens that enhance immunological protection.