自噬抑制剂促进缺氧诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡简

 目的 探讨抑制自噬后对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧诱导的促凋亡蛋白Bim、caspase-3表达的影响及低氧诱导因子1（HIF-1）的调控作用。方法 体外培养1～3d 龄SD大鼠心肌细胞建立缺氧模型,检测缺氧0、2、4、8、14和24h时自噬情况,取自噬显著升高的时间点细胞作为单纯缺氧组（anoxia组）,缺氧前用10mmol/L3-甲基腺嘌呤（3MA）预处理心肌细胞1h作为缺氧+3-甲基腺嘌呤组（anoxia+3MA组）,设立正常对照组（control组）。倒置显微镜下观察各组心肌细胞的搏动频率和异常节律;全自动血液生化分析仪检测乳酸脱氢酶LDH的活性;Western blot检测各组中LC3-II/ I、Bim、caspase-3和HIF-1蛋白表达情况。结果 抑制自噬后心肌细胞搏动频率明显减弱并可见异常节律、LDH释放增加（P<0.05）,同时Bim和caspase-3表达明显升高（P<0.05）;缺氧+3MA组中HIF-1蛋白表达明显低于单纯缺氧组（P<0.05）。结论 自噬抑制剂抑制自噬后导致缺氧诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡增加,HIF-1正调控缺氧诱导的自噬抵抗凋亡发挥心肌保护作用。     

沉默bim的表达对缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡的影响

 目的：探讨唯BH3域蛋白Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell  death)在缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法：在体外原代培养出生1~3 d的大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组：（1）正常对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+bim-siRNA组。倒置显微镜下观察心肌细胞的搏动频率和节律。全自动生化分析术检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,用MTT法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Western blotting 检测细胞Bim、 Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表达。结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。bim-siRNA转染均能有效沉默bim基因的表达（P<0.01）,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧使心肌细胞的搏动频率显著减慢,节律不规则,而沉默bim基因的表达能使细胞搏动频率增加。缺氧损伤导致细胞培养液中LDH含量较空白对照组明显增加（P<0.01）,心肌细胞存活率明显下降（P<0.05）,细胞凋亡率较空白对照组明显增加（P<0.01）,转染bim-siRNA后细胞培养液中LDH含量显著减少,细胞存活率升高,细胞凋亡率下降。缺氧损伤导致心肌细胞Bax和p-p38 MAPK表达升高（P<0.05或P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下降（P<0.01）,bim-siRNA的转染能够抑制缺氧导致的上述改变（P<0.01或P<0.05）,并且与心肌细胞凋亡发生率降低一致,p38 MAPK表达无明显变化。结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制Bax、p-p38 MAPK的表达和增强Bcl-2蛋白表达有关,这有望为冠心病的治疗提供新方向。     

shRNA沉默 ROCK1和ROCK2 表达对缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的: 探讨Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1)和ROCK2在缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法: 原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+阴性对照shRNA组;(4)缺氧+ROCK1-shRNA组;(5)缺氧+ROCK2-shRNA组。用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;用MTT检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;用Western blotting检测ROCK1和ROCK2的表达,并检测caspase-3和p-PI3K的表达情况。结果: 鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.01)。MTT检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低(P<0.05),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。Western blotting检测发现,ROCK1-shRNA的转染能降低ROCK1的表达(P<0.05), ROCK2-shRNA的转染能降低ROCK2的表达(P<0.01);缺氧能导致caspase-3表达升高(P<0.05)、p-PI3K表达降低(P<0.01),ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。结论: ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞凋亡,其机制与抑制caspase-3活化和增强p-PI3K的表达有关。     

自噬降低激活β1-AA诱导的心肌细胞内质网应激相关凋亡途径

目的β1-肾上腺素受体自身抗体(β1-AA)诱导的心肌细胞自噬降低是否参与内质网应激(ERS)相关凋亡途径的激活。方法β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII)抗原肽段主动免疫大鼠;亲和层析法纯化血清中的β1-AA; SDS-PAGE检测抗体纯度; Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62的表达; Western blot及免疫组化法检测内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡途径相关蛋白GRP78、CHOP和caspase-12的表达。结果与对照组相比,β1-AA处理H9c2心肌细胞12和24 h后,Beclin1和LC3蛋白表达明显降低,p62蛋白表达明显增加;β1-AA作用12和24 h后,GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达均显著增加; 3MA抑制心肌细胞自噬后β1-AA诱导的ERS相关凋亡途径进一步激活; Rapa上调心肌细胞自噬水平后可明显逆转β1-AA诱导的ERS相关凋亡途径的激活。结论 1)β1-AA可以引起心肌细胞自噬降低,并诱导ERS相关凋亡途径激活; 2)自噬降低参与β1-AA诱导的心肌细胞ERS相关凋亡途径的激活。     

内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用

 目的：探讨内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法：在体外原代培养出生1~3 d大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组：（1）空白对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+Bim-siRNA组。MTT法观察细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;Western blotting检测内质网应激标志分子caspase-12和三磷酸肌醇（IP3）的表达情况。结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。在荧光显微镜下,转染了阴性对照siRNA组的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;Western blotting 结果显示,Bim-siRNA转染均能有效降低Bim蛋白的表达,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧损伤导致心肌细胞活性明显下降（P<005）,转染Bim-siRNA后细胞活性较阴性对照组升高。缺氧细胞凋亡率较对照组明显增加（P<0.01）,细胞内钙离子浓度明显增高,而沉默bim的表达能降低细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度。缺氧导致内质网应激标志分子caspase-12和IP3表达较空白对照组明显上调（均P<005）,而抑制Bim表达后caspase-12和IP3表达明显降低。结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,内质网应激标志分子caspase-12和IP3可能参与了Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡的过程。这有望为临床心肌缺血缺氧损伤的治疗提供新思路。     

自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)凋亡中的作用。方法:常规培养HPAECs,分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组和3-MA+CSE组,应用Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察细胞自噬泡形成,Western bolt测定自噬相关蛋白beclin-1、LC3与cleaved caspase-3的水平。结果:MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡,Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高,3-MA预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加,在3-MA+CSE组,细胞凋亡率较CSE组进一步升高;同时,CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P0.05),3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论:CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡,抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用,这种作用可通过激活caspase-3实现。     

缺氧诱导因子-1α参与缺氧条件下小胶质细胞的自噬和凋亡

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)在缺氧诱导小胶质细胞自噬和凋亡中的作用。方法:体外培养大鼠小胶质细胞,缺氧处理后利用Iba1免疫组织化学法标记小胶质细胞;用RT-PCR检测缺氧后HIF-1αm RNA的表达;Western Blot检测HIF-1α和自噬标记物LC3的蛋白表达;TUNEL染色法检测细胞凋亡。针对大鼠HIF-1α基因序列构建特异的si RNA并转染小胶质细胞,检测缺氧后LC3表达与细胞凋亡的改变。结果:与对照组相比,缺氧后Iba1表达明显增强、HIF-1α和自噬标记物LC3-II表达上升(P0.05)、衡量细胞自噬水平的LC-II/LC3-I比值增高(P0.05),TUNEL+细胞百分数(35.6±5.9%)较对照组(6.8±1.2%)比较显著增加(P0.05);沉默HIF-1α表达后,LC3-II蛋白和LC-II/LC3-I比值均降低(P0.05)、TUNEL+细胞百分数(23.0±0.8%)较对照组(40.1±4.5%)比较亦显著减少(P0.05)。结论:HIF-1α参与缺氧条件下小胶质细胞的自噬和凋亡。     

自噬抑制增强白藜芦醇对人软骨肉瘤细胞凋亡的诱导

目的:研究白藜芦醇(resveratrol,Res)诱导软骨肉瘤细胞凋亡的同时是否激活自噬及自噬抑制剂联合白藜芦醇对软骨肉瘤细胞的作用。方法:SW1353软骨肉瘤细胞设对照组、Res组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)组及Res+3MA组,用透射电镜观察对照组及Res组细胞自噬体,CCK-8法反映4组细胞活力,Western blotting测cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2表达量及TUNEL法来反映4组细胞凋亡情况,Western blotting检测Beclin1、LC3-Ⅱ及p62表达量反映4组细胞自噬情况。结果:在Res作用下,正常细胞活力下降和凋亡水平上升的同时,自噬水平明显上升(P0.05);应用3MA下调正常细胞自噬水平后,3MA组凋亡水平较正常组上升(P0.05);在Res联合3MA作用下,Res+3MA组较Res组细胞活力和细胞自噬水平显著下降(P0.05),而凋亡水平显著上升(P0.05)。结论:Res诱导软骨肉瘤细胞凋亡的同时,上调细胞自噬水平;自噬抑制增强Res对人软骨肉瘤细胞凋亡的诱导。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

黄芪总苷通过介导mTOR信号通路抑制H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞自噬和凋亡

目的:探讨黄芪总苷(astragalosides)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的大鼠心肌细胞H9c2自噬和凋亡作用的影响及作用机制。方法:建立大鼠心肌细胞H_2O_2氧化应激损伤模型,并用20 mg/L的黄芪总苷和0.1 mg/L的雷帕霉素分别处理对应组细胞。采用流式细胞技术检测细胞凋亡率;采用吖啶橙染色观察细胞自噬情况;采用Western blot检测p-mTOR蛋白、P70S6K蛋白、自噬蛋白(LC3)和凋亡蛋白(cleaved caspase-3和caspase-3)的表达。结果:与模型组和雷帕霉素组比较,黄芪总苷组的细胞凋亡率显著降低(P0.05);黄芪总苷组的大鼠心肌H9c2细胞形态完整,细胞核染色为黄绿色荧光,染色质分布均匀,细胞形状规则;细胞中p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白的表达显著升高(P0.05),LC3-II/LC-3-I和cleaved caspase-3相对表达量显著降低(P0.05)。结论:黄芪总苷可通过mTOR信号通路提高心肌细胞成活率,抑制细胞凋亡和自噬,减轻H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤。     

沉默信息调节因子1对缺氧心肌细胞凋亡和自噬的影响

目的:分析沉默信息调节因子1(Sirt1)对缺氧条件下心肌细胞凋亡和自噬的影响。方法:将心肌H9c2细胞分为Control组、Hypoxia组(缺氧处理24h)、NC+Hypoxia组(转染阴性对照并缺氧处理24h)和Sirt1+Hypoxia组(转染Sirt1过表达载体并缺氧处理24h)。以qRT-PCR和Western blot测定心肌细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平,MTT方法评估细胞存活率,流式细胞术测定细胞总凋亡水平,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3水平和自噬蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平。结果:与Control组比较,Hypoxia组细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平降低,细胞存活率降低,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平降低(P0.05)。与NC+Hypoxia组比较,Sirt1+Hypoxia组细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平升高,细胞存活率升高,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平升高(P0.05)。结论:Sirt1可抑制缺氧心肌细胞凋亡并诱导细胞自噬。     

利拉鲁肽对缺氧诱导的心肌细胞凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的 检测胰高血糖素样肽-利拉鲁肽对氯化钴(cobalt chloride, CoCl2)诱导缺氧条件下的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2表达量的影响.方法 将原代培养的心肌细胞分为6组:空白对照组,CoCl2诱导化学缺氧组,缺氧+不同剂量利拉鲁肽处理组(1、10、100、1000nmol/L利拉鲁肽).结果 缺氧能诱导心肌细胞中凋亡蛋白Bcl-2表达的增高并抑制Caspase-3蛋白的表达(P<0.05);利拉鲁肽能抑制缺氧诱导的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达并增加Bcl-2的表达,且利拉鲁肽对凋亡蛋白的影响具有剂量依赖性.结论 利拉鲁肽抑制缺氧诱导的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达,并促进凋亡蛋白Bcl-2的表达.     

HIE幼龄大鼠神经元自噬诱导线粒体功能障碍的研究

目的:探讨细胞自噬对缺氧缺血性脑病(HIE)幼龄大鼠神经元线粒体功能的影响。方法:随机选取10日龄SPF级SD大鼠30只,分为假手术(sham)组和HIE组,后者结扎单侧颈总动脉复制缺血缺氧模型。取脑组织行镜下病理观察,免疫组化分析活化型caspase-3和LC3B-II蛋白表达;体外实验中观察缺氧诱导的原代大鼠神经元的自噬过程,Western blot检测相关蛋白,并对大鼠神经元线粒体功能进行测试。结果:(1)与sham组相比,HIE组大鼠出现脑萎缩和脑室增宽;HIE组免疫组化显示活化型caspase-3和LC3B-II蛋白表达上调(P<0.01);(2)体外细胞实验发现,缺氧可诱导大鼠神经元出现自噬和凋亡;(3)与sham组相比,单纯缺氧的神经元内活性氧簇增加,线粒体超氧化物上调,线粒体跨膜电位降低(P<0.01)。结论:在HIE大鼠模型中,缺氧诱导的神经元线粒体功能障碍,可能与缺氧时神经元出现的自噬和凋亡有关。这一结果将为临床上开发细胞自噬因子类药物治疗HIE提供了新的思路。     

自噬在高糖高脂引起心肌细胞系H9C2凋亡中的影响

目的探究自噬在高糖高脂(HGHL)引起的心肌细胞系H9C2凋亡中的影响。方法不同浓度高糖高脂处理H9C2心肌细胞不同时间,HE染色并测量心肌细胞表面积;流式细胞计量术检测细胞活性和凋亡率,确定心肌细胞肥大及凋亡的最适浓度和时间;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬指标LC3Ⅱ、自噬信号通路p62/SQSTM1(p62)、Beclin-1、LAMP2蛋白表达以及自噬抑制剂氯喹预处理后cleaved caspase-3蛋白表达。结果HGHL处理后H9C2心肌细胞肥大呈浓度和时间依赖性,36 h最显著(P0.001);细胞凋亡呈浓度和时间依赖性增高,36 h凋亡率约50%(P0.001);与对照组相比,HGHL诱导24 h时LC3Ⅱ蛋白水平显著增加(P0.01),Beclin-1、LAMP2蛋白水平显著下降(P0.05),而p62蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组以及干预组相比,氯喹预处理1 h后cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P0.01)。结论 HGHL诱导H9C2心肌细胞肥大并促进其凋亡。HGHL通过同时抑制自噬形成和降解,使自噬体异常堆积,导致细胞凋亡。这表明抑制自噬可能是促进细胞凋亡的重要原因。     

HBSP减轻急性缺氧复氧大鼠心肌细胞损伤

目的研究促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对急性缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养H9C2乳鼠心肌细胞系,建立缺氧(3 h)/复氧(3 h)模型。实验分为对照组、缺氧/复氧组(A/R)、A/R+HBSP组。测定培养细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量;用annexin-V与PI双染法及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;分离细胞质与线粒体,用Western blot法检测线粒体内和胞浆中的细胞色素C蛋白的表达,用caspase试剂盒检测心肌细胞caspase-9及caspase-3的表达。结果与正常对照组比较,A/R组细胞存活率和线粒体内细胞色素C蛋白水平明显下降(P0.01),而凋亡率、caspase-9、caspase-3活性及胞质内细胞色素C蛋白水平均显著升高(P0.01)。结论HBSP对缺氧复氧乳鼠心肌细胞具有明显的保护作用,其机制可能与抑制线粒体途径介导的细胞凋亡有关。     

Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的交互作用及机制研究

目的:探讨受体相互作用蛋白2(Rip2)诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的交互作用及其机制。方法:用jetPRIME将pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2重组质粒分别转染至人胰腺癌Panc-1细胞。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于过表达Rip2的细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达;比色法检测caspase-8、-9、-3的活性。此外,用caspases抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达Rip2的细胞,Western blot检测自噬相关蛋白及PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量及形态。结果:(1)pEGFP-Rip2组细胞凋亡率显著高于对照组和pEGFP-C2组(P0. 05),而pEGFP-Rip2+3-MA组细胞凋亡率进一步升高(P0. 05);与pEGFP-Rip2组比较,pEGFP-Rip2+3-MA组细胞Fas、Bax和胞浆细胞色素c(Cyt-c)蛋白表达水平显著升高(P0. 05),Bcl-2蛋白表达水平则显著下降(P0. 05);pEGFP-Rip2+3-MA组细胞caspase-8、-9、-3的活性显著高于pEGFP-Rip2组(P0. 05)。(2)pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著高于pEGFP-Rip2组(P0. 05),细胞内自噬体的数量亦显著多于pEGFP-Rip2组(P0. 05);此外,与pEGFP-Rip2组比较,pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK组细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著降低(P0. 05),而mTOR及Akt蛋白水平无显著改变。结论:抑制胰腺癌细胞自噬可促进Rip2诱导的细胞凋亡,其机制可能与进一步激活内、外源性凋亡途径有关。抑制胰腺癌细胞凋亡可促进Rip2诱导的细胞自噬,其机制可能与进一步抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化有关。因此,Rip2诱导的胰腺癌细胞自噬和凋亡之间可能具有交互拮抗作用。     

京尼平对缺氧/复氧损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨京尼平对缺氧/复氧(H/R)损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响。方法 建立H/R损伤模型,体外培养的大鼠H9c2心肌细胞行缺氧12 h、复氧4 h。实验分为对照组（Con）、京尼平组(GE)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧/复氧+京尼平组(H/R+GE)。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,透射电子显微镜观察自噬体,Western blotting检测Bax、Bcl-2、P62、Beclin1、LC3-Ⅱ、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和p-mTOR蛋白的表达。结果 京尼平预处理增强了H/R损伤后的H9c2心肌细胞活力,抑制细胞凋亡及自噬体累积,降低自噬结构断面积与细胞质断面积的比值。Western blotting结果显示,京尼平预处理减少了H/R损伤后Bax、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达,增加Bcl-2、P62、p-Akt和p-mTOR蛋白表达。结论 京尼平可以抑制H/R损伤后心肌细胞凋亡及自噬,其机制可能与上调Akt/mTOR信号通路有关。     

HBSP抑制缺氧复氧心肌H9C2细胞Omi/HtrA2胞内转位及细胞凋亡

目的探讨促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对缺氧复氧心肌细胞Omi/Htr A2胞内转位及细胞凋亡的影响。方法将乳鼠心肌细胞(H9C2细胞)分为对照(Ctrl)组、缺氧复氧(H/R)组、HBSP组和EPO组。培养结束后MTS法检测细胞存活率,酶标仪检测细胞上清液中LDH释放率,Western blot检测细胞内cleaved caspase-3表达,TUNEL法检测心肌细胞凋亡;分离H9C2细胞胞质及线粒体,Western blot分别检测线粒体及细胞质Omi/Htr A2表达。结果与Ctrl组相比,H/R组细胞存活率下降(P0.05),LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/Htr A2胞内转位均明显上升(P0.05);与H/R组相比,EPO组的细胞存活率升高(P0.05),LDH释放降低、cleaved caspase-3表达减弱、心肌细胞凋亡减少、Omi/Htr A2线粒体转位明显减少(P0.05);随着HBSP浓度的增加,各组细胞存活率逐渐上升,LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/Htr A2胞内转位率逐渐下降(P0.05)。结论 HBSP具有与EPO类似的保护作用,可抑制经H/R诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能是通过减少Omi/Htr A2蛋白的胞内转位,抑制caspases通路激活,进而发挥细胞保护作用。     

白芍总苷预处理对乳鼠心肌缺血再灌注心肌细胞糖调节蛋白78、增强子结合蛋白同源蛋白、caspase-12表达及凋亡的影响

目的:观察白芍总苷(TGP)预处理对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞糖调节蛋白78(GRP78)、增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、caspase-12表达及凋亡的影响。方法:差速贴壁法培养的乳鼠心肌细胞,随机分为正常对照组、白芍总苷组、缺血再灌注组(缺氧3 h,复氧1 h)、心肌缺血再灌注+低、中、高剂量白芍总苷组终浓度为25、50、100mg/L预处理24 h后,再置于上述缺氧复氧环境中培养,MTT法检测各组活细胞数、流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率,免疫印迹检测细胞GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表达。结果:与缺血再灌注组相比,白芍总苷对降低GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表达、提升心肌细胞存活率并降低细胞凋亡率呈浓度依赖性。结论:白芍总苷对乳鼠心肌细胞缺血再灌注具有提高心肌细胞存活率和降低细胞凋亡率作用,其机制可能与抑制心肌细胞内质网应激相关蛋白GRP78表达,下凋CHOP、caspase-12水平等有关。     

促红细胞生成素联合粒细胞集落刺激因子对大鼠缺氧心肌细胞的保护效应研究

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对大鼠缺氧心肌细胞的保护机制.方法 采用胰酶消化大鼠心肌细胞并传代,用150 μmol/L浓度的CoCl2处理心肌细胞,模拟缺氧条件.采用流式细胞仪检测不同EPO+ G-CSF浓度下心肌细胞的凋亡和坏死水平.筛选出最适浓度后,将实验组分为对照组、缺氧组、缺氧+ EPO组、缺氧+G-CSF组和缺氧+EPO+ G-CSF组,Western blot法检测乏氧诱导因子(HIF)-1α、P53、PARP蛋白的表达变化.结果 心肌细胞在10 U/mLEPO+200 ng/mL G-CSF培养下,心肌细胞凋亡和坏死水平最低,故认为是最适浓度(F=14.73、11.95,P ＜0.05).和对照组相比,HIF-1α、P53和PARP蛋白在各实验组中表达水平均升高,HIF-1α以缺氧组升高最显著(F=22.65,P＜0.05),P53以缺氧+EPO+ G-CSF组升高最显著(F =25.18,P＜0.05).除对照组外,PARP蛋白在实验组中呈现逐渐降低趋势(F=17.48,P＜0.05).结论 EPO-G-CSF能降低缺氧的心肌细胞凋亡、坏死和DNA损伤,其机制可能与HIF-1α、P53、PARP蛋白表达相关.