运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系

目的 探讨普通重力和模拟微重力条件下构建许旺细胞三维培养体系的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰;分别在普通重力和模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上,观察许旺细胞的粘附生长情况。结果 两种重力条件下许旺细胞在聚羟基乙酸支架表面都能良好贴壁生长,培养2d时细胞生长稳定、密度适中;模拟微重力条件下许旺细胞在支架表面的分布更均匀。结论 普通重力和模拟微重力环境都适宜构建许旺细胞的三维培养体系,模拟微重力环境可能为有利。     

模拟微重力培养肝细胞的形态特点

目的　模拟微重力方法培养大鼠原代肝细胞 ,初步分析其形态学特点及其意义。方法　改良Seglen原位胶原酶灌注法获得大鼠肝脏单细胞悬液 ,2 .2× 10 5个 /ml加微载体Cytodex 3(4 g/L)接种 ,采用旋转细胞培养系统 (RCCS)进行模拟微重力培养。第 0、6、2 4、72、12 0、168小时取样 ,相差、体视显微镜观察活细胞形态 ,第 2 4小时标本苏木素 伊红 (HE)染色观察组织学形态 ,电镜观察超微结构。结果　模拟微重力培养中肝细胞 2 4h内贴附微载体并出现三维结构 ,2 4～ 72h发展为独特的肝细胞 微载体聚球体。电镜下可见细胞膜的 3种不同形态 ,其分布与功能相一致。结论　模拟微重力培养方法能使肝细胞形成分化的三维类组织结构 ,在组织工程领域存在良好的应用前景     

模拟微重力培养对大鼠甲状旁腺细胞形态及分泌功能的影响

目的模拟微重力培养甲状旁腺细胞,观察细胞形态及细胞分泌功能,以探讨甲状旁腺细胞更为优良的培养方法。方法雄性Wistar大鼠,37只,体质量150~200 g。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。手术切取甲状旁腺并经病理学证实。用胶原酶Ⅱ消化获得甲状旁腺细胞后,按培养条件不同分为普通培养组(单纯甲状旁腺细胞静置培养)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)支架培养组(甲状旁腺细胞接种在PGA支架上静置培养)、微重力培养组(甲状旁腺细胞和PGA支架在模拟微重力环境中共培养)3组。于细胞培养第1、3、5、7天时测量各组细胞培养液中甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)的浓度,于倒置相差显微镜下观察甲状旁腺细胞的生长形态、吖啶橙/碘化丙啶染色细胞并计算细胞存活率。结果普通培养组的细胞在第7天时大部分细胞形态良好,部分细胞团中心出现坏死灶。PGA支架培养组在第7天时支架上的细胞大部分沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展,相邻支架被细胞外基质连接。微重力培养组的细胞在培养第7天时细胞仍呈圆形,相互聚集成团,并逐渐增大;培养液中的PTH浓度也明显高于PGA支架培养组和普通培养组(P0.05),且存活率也明显高于另外两组(P0.05)。结论模拟微重力培养甲状旁腺细胞,能使细胞保持良好形态,并显著提高细胞活力及存活率,从而为细胞输注移植治疗甲状旁腺功能减退症提供优良的供体细胞,PGA支架可以作为甲状旁腺细胞培养的良好载体。     

变频振动在模拟微重力环境下对成骨细胞增殖和分化 的影响

目的观察变频振动在模拟微重力环境下对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响。方法利用沿水平轴连续回转(30 r/min)细胞培养系统模拟微重力环境,应用电磁振动台将振动强度为0.5 g(g为加速度)在不同频率45 Hz、90 Hz、变频(5~90 Hz)振动应力作用于新生24 h大鼠颅盖骨成骨细胞,分别使用MTT比色法和碱性磷酸酶(ALP)活性测定了解成骨细胞的增殖和分化情况。结果模拟微重力环境可以抑制新生24 h大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖和分化功能;90 Hz和5~90Hz变频振动促进模拟微重力环境成骨细胞的增殖功能(p0.01);45 Hz(p0.05)和5~90 Hz(p0.01)变频振动刺激对模拟微重力环境成骨细胞的分化功能具有一定的保护作用。结论在模拟微重力环境下机械振动对成骨细胞的增殖和分化功能具有保护作用,这为机械振动刺激防治微重力环境下骨丢失提供了理论和实验依据。     

模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究

[目的]探讨模拟微重力作为软骨组织工程培养方法的作用和胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙(trical ciumphosphate,TCP)层状梯度修复体作为关节软骨组织工程支架的可行性.[方法]体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上,模拟微重力和普通环境下三维立体分别培养3周,通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测微重力对软骨细胞培养的影响和支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.[结果]软骨细胞/修复体体外培养3周,软骨细胞模拟微重力培养组明显比普通培养组在层状修复体上分布均匀,修复体中心软骨细胞数量明显较多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.[结论]模拟微重力环境有利于软骨细胞在三维支架上的均匀增殖,有望成为软骨组织工程中的一种重要培养方法;胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体,细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料.     

三维及二维培养大鼠胰腺导管来源干细胞的体外对比实验研究

目的观察在不同培养模式下大鼠胰腺导管来源干细胞(PDSC)的生物学特性。方法以大鼠胰腺组织为材料,采用动力性三维培养及传统二维培养方法进行细胞培养,获得原代PDSC,并连续传代,纯化PDSC,比较动力性三维培养及传统二维培养细胞间连接及细胞凋亡周期的差异。结果动力性三维培养的大鼠PDSC在培养第2天即可沿三维支架贴壁生长,在第7天即可形成细胞团,并沿三维支架多向贴壁生长;二维培养的PDSC在培养第5天贴壁生长。三维培养与二维培养相比,二维培养的细胞间连接少见,三维培养的细胞连接结构丰富。三维培养与二维培养相比,三维培养的G1期细胞增多,G2期细胞相对减少(P<0.01),三维培养早期自发凋亡细胞比例相对减少(P<0.05),晚期自发凋亡与坏死细胞比例两种培养方式间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论动力性三维细胞培养较传统二维细胞培养,在细胞贴壁时间、细胞连接以及细胞凋亡方面具有明显的优势。     

动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

模拟微重力培养在骨和软骨组织工程中的应用

骨和软骨组织工程主要致力于骨和软骨的形成和再生,通过建立细胞与生物材料的三维复合物,构建具有生物活性的组织,进而对受损的骨和软骨组织进行形态结构和功能的重建以求达到永久性替代.目前模拟微重力条件下骨和软骨组织工程的研究表明,微重力培养环境有利于细胞体外增殖和分化,并维持细胞的表型;有利于细胞和材料的三维立体复合;有利于构建的组织更接近于活体.因此微重力细胞培养为骨和软骨组织工程的研究开辟了新的道路.     

模拟微重力下转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

目的:观察模拟微重力条件下体外转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)向髓核样细胞表型分化的效果。方法:取成年兔骨髓间充质干细胞分离培养并增殖至第3代后建立3个培养组:微重力诱导培养组(A组),将经TGF-β1转染后的BMMSCs在藻酸钙凝胶微球及旋转式细胞培养系统内进行模拟微重力条件下动态培养;诱导培养组(B组),将经TGF-β1转染后的BMMSCs在藻酸钙凝胶微球内培养;模拟微重力自然分化组(C组),将BMMSCs在藻酸钙凝胶微球内置于旋转式细胞培养系统内培养。在培养的第3、7、14、21天分别检测以上各组BMMSCs中TGF-β1的含量变化及BMMSCs的增殖能力,应用免疫组化、甲苯胺蓝染色检测各组Ⅱ型胶原表达情况,采用RT-PCR法检测各组BMMSCs的蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达。结果:培养至第14天,A、B组中已可观察到呈多角形的类髓核样细胞,C组呈不规则形。从第3天开始,上清液中TGF-β1的含量和BMMSCs中DNA的含量A组较B、C两组明显增高(P<0.05),且随时间的延长而逐渐增高。A组在免疫组化染色中可见Ⅱ型胶原蛋白染色阳性,B组呈弱阳性,C组无明显变化。RT-PCR结果显示A、B组的BMMSCs中已有蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达。结论:模拟微重力条件下TGF-β1转染的BMMSCs在一定时间内可增加合成蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白的能力。     

海螵蛸与兔软骨细胞组织的生物相容性

目的 探讨海螵蛸作为新生兔关节软骨体外细胞培养支架材料的可行性.方法 消化分离新生兔关节软骨细胞,接种于自制海螵蛸片支架上培养,从倒置相差显微镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞的吸附力.结果 预湿海螵蛸支架的亲水性优于未预湿海螵蛸支架,使软骨细胞更易扩散至支架孔隙.软骨细胞-支架复合体培养1周后,细胞开始在预湿海螵蛸支架上黏附、伸展、增殖;2周后细胞融合成片,布满整个支架孔隙并产生基质.结论 海螵蛸多孔支架与兔软骨细胞具有良好的生物相容性,可以作为软骨组织工程中细胞培养支架的新材料.     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

Tissue engineering in cardiovascular surgery: new approach to develop completely human autologous tissue.

OBJECTIVE: In cardiovascular tissue engineering, three-dimensional scaffolds serve as physical supports and templates for cell attachment and tissue development. Currently used scaffolds are still far from ideal, they are potentially immunogenic and they show toxic degradation and inflammatory reactions. The aim of this study is to develop a new method for a three-dimensional completely autologous human tissue without using any scaffold materials. METHODS: Human aortic tissue is harvested from the ascending aorta in the operation room and worked up to pure human myofibroblasts cultures. These human aortic myofibroblasts cultures (1.5x10(6) cells, passage 3) were seeded into 15-cm culture dishes. Cells were cultured with Dulbecco' s modified Eagle's medium supplemented with 1 mM L-ascorbic acid 2-phosphate for 4 weeks to form myofibroblast sheets. The harvested cell sheets were folded to form four-layer sheets. The folded sheets were then framed up and cultured for another 4 weeks. Tissue development was evaluated by biochemical assay and light and electron microscopy. RESULTS: After 4 weeks of culture in ascorbic acid supplemented medium, myofibroblasts formed thin cell sheets in culture dishes. The cell sheets presented in a multi-layered pattern surrounded by extracellular matrices. Cultured for additional 4 weeks on the frames, the folded sheets further developed into more solid and flexible tissues. Light microscopy documented a structure resembling to a native tissue with confluent extracellular matrix. Under transmission electron microscope, viable cells and confluent bundles of striated mature collagen fibers were observed. Hydroxyproline assays showed significant increase of collagen content after culturing on the frames and were 80.5% of that of natural human pericardium. CONCLUSIONS: Improved cell culture technique may render human aortic myofibroblasts to a native tissue-like structure. A three-dimensional completely autologous human tissue may be further developed on the base of this structure with no show toxic degradation or inflammatory reactions.     

骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸材料治疗大鼠神经损伤的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及其分化的神经样细胞分别与聚乳酸-羟基乙酸(polylactic glycolic acid,PLGA)支架材料复合修复大鼠神经损伤的效果.方法 将BMSCs复合PIGA培养,通过扫描电镜观察BMSCs在PLG...     

Establishing the Framework to Support Bioartificial Heart Fabrication Using Fibrin‐Based Three‐Dimensional Artificial Heart Muscle

Only 3000 heart transplants are performed in the USA every year, leaving some 30 000–70 000 Americans without proper care. Current treatment modalities for heart failure have saved many lives yet still do not correct the underlying problems of congestive heart failure. Tissue engineering represents a potential field of study wherein a combination of cells, scaffolds, and/or bioreactors can be utilized to create constructs to mimic, replace, and/or repair defective tissue. The focus of this study was to generate a bioartificial heart (BAH) model using artificial heart muscle (AHM), composed of fibrin gel and neonatal rat cardiac myocytes, and a decellularized scaffold, formed by subjecting an adult rat heart to a series of decellularization solutions. By suturing the AHM around the outside of the decellularized heart and culturing while suspended in media, we were able to retain functional cardiac cells on the scaffold as evinced by visible contractility. Observed contractility rate was correlated with biopotential measurements to confirm essential functionality of cardiac constructs. Cross‐sections of the BAH show successful decellularization of the scaffold and contiguous cell‐rich AHM around the perimeter of the heart.     

蚕丝在软骨细胞立体培养中的应用

目的 观察蚕丝对软骨细胞的吸附作用及蚕丝对软骨细胞形态和功能的影响。方法 从家蚕蚕茧中抽丝所得的蚕丝经胰蛋白酶消化和聚乳酸包埋,制成三维支架,软骨细胞与蚕丝三维支架进行复合培养,利用相差倒置显微镜、扫描电镜观察软骨细胞生长情况。结果 蚕丝三维支架上滴加软骨细胞悬液后,软骨细胞在不规则轻微漂动和缓慢下沉过程中粘附在蚕丝上,１～２天后完全贴壁。培养３天后软骨细胞开始分裂;５天后,细胞生长增殖十分活跃;     

包埋后的几丁质与软骨细胞体外培养的实验研究

目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或工同包埋几丁质与软骨细胞体外培养,观察其产亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抵制作用;以卵磷脂包埋的几柄质亲水性增强;以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强;以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力,并可使细胞更好地发挥功能     

Adhesive growth of pancreatic islet cells on a polyglycolic acid fibrous scaffold

BACKGROUND: The use of cultured pancreatic islet cells for diabetes treatment offers several advantages. In theory, cultured cells show greater purity and lower immunogenicity. However, cultured islet cells display a low survival rate in vitro. In the present study we grew islet cells on a polyglycolic acid (PGA) fibrous scaffold to promote cell adhesion, growth, and viability during prolonged culture. METHODS: Islets isolated from Wistar rat pancreata were digested with collagenase and purified by the Ficoll method. Cells were grown in culture with or without PGA scaffolds. Islet cell purity was determined using a dithizone stain; viability and survival rates were determined using an AO-PI stain. The insulin-secretion index was detected using radioimmunodetection and the growth on an adhesive scaffold analyzed using an inverted microscope and scanning electron microscope (SEM). RESULTS: In contrast to the scaffold-free control group, cells cultured on PGA scaffolds exhibited improved morphology, less cell death, and prolonged survival times. Cell viability and survival rates were significantly increased in scaffolded cells when compared to control cells (P < .05). Increased insulin secretion was observed in the culture solution of scaffolded cells following stimulation with low glucose (5.6 mmol/L) versus high glucose (16.7 mmol/L). The secretion indices of the two groups were significantly different (P < .05). Islet cell growth, as observed under SEM, was tightly circumvolute, adhesive, and three-dimensional. CONCLUSIONS: The present results demonstrated that islet cells can successfully grow and survive in culture on a PGA scaffold. These cells exhibited enhanced viability, survival, and insulin secretion.     

碱性成纤维细胞生长因子调节兔关节软骨细胞与包埋后聚乳酸体外培养的实验研究

目的 通过碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）调节卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚乳酸三维支架与兔关节软骨细胞的体外培养,观察bFGF对组织工程软骨细胞生长的调节作用,探寻软骨组织工程的适宜方法。方法将体外培养的第3代兔关节软骨细胞种植于卵磷脂和多聚赖氨酸包埋的聚乳酸三维支架,加入bFGF共同培养,行大体、倒置显微镜、扫描电镜及免疫组织化学观察,分析软骨组织的形成,并行统计学分析。结果通过bFGF调节的卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚乳酸三维支架一关节软骨细胞复合物在培养过程中不仅能够保持其初始外形,而且能保持种植细胞稳定的三维均相分布,无细胞脱落现象。同时脆性亦逐渐降低,韧性增加,有弹性,表面湿润、光滑,培养2周后,逐渐形成富含Ⅱ型胶原,具有典型软骨组织结构的成熟工程化软骨。其细胞生长及胶原分泌量明显强于对照组,统计学分析有显著性差异。结论bFGF能够促进组织工程软骨细胞的增殖,并具有增强软骨细胞功能的作用。     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.