缩宫素对人骨肉瘤细胞系MG-63增殖及成骨活性的影响

目的：研究缩宫素（OT）对人成骨细胞系MG-63增殖及成骨活性的影响，阐明其在骨代谢调节方面的作用。方法：用含OT 10、50和100 nmol/L的培养基孵育MG-63细胞1、3、5和7 d采用MTT法检测OT作用下细胞增殖活性的变化，选择其中最低有效浓度进一步检测OT作用下MG-63碱性磷酸酶（ALP）活性的变化。结果：MTT法检测显示，50和100 nmol/L OT作用1、3、5和7 d后MG-63细胞的增殖活性明显高于对照组（P<0.05）；10 nmol/L作用7 d后MG-63细胞增殖活性明显高于对照组（P<0.05）。ELISA检测显示，50 nmol/L　OT作用3、5和7 d后MG-63细胞ALP活性明显高于对照组（P<0.05）。结论：OT对MG-63细胞增殖有调节作用，能够正向促进成骨细胞的增殖和分化。     

丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建及其生物相容性

目的: 筛选出最适合用于骨组织工程的丝素蛋白壳聚糖三维支架比例。方法: 将提取的丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液以不同质量比混合,冷冻干燥后构建以下各组丝素蛋白壳聚糖三维多孔支架：20%丝素蛋白 ∶80%壳聚糖（20%丝素蛋白组）、30%丝素蛋白 ∶70%壳聚糖（30%丝素蛋白组）、40%丝素蛋白 ∶60%壳聚糖（40%丝素蛋白组）、50%丝素蛋白 ∶50%壳聚糖（50%丝素蛋白组）、纯丝素蛋白组、纯壳聚糖组。采用扫描电镜观察各组三维支架表面形态;将MG-63细胞与丝素蛋白/壳聚糖三维支架共培养（对照组采用盖玻片培养MG-63细胞）,通过细胞计数计算细胞黏附率,通过MTT检测细胞增殖;通过扫描电镜观察MG-63细胞在40%丝素蛋白、50%丝素蛋白三维支架中的形态分布;采用pNPP显色液检测40%丝素蛋白、50%丝素蛋白三维支架中MG-63细胞碱性磷酸酶（ALP）含量。结果： 不同比例丝素蛋白/壳聚糖三维支架中,50%丝素蛋白、40%丝素蛋白支架表面孔隙结构相对规则;黏附率结果显示,三维支架中丝素蛋白含量最少时,支架的细胞黏附率也最低;MTT显示50%丝素蛋白组细胞增殖能力强于其他组支架;MG-63细胞与支架共培养时,50%丝素蛋白支架中细胞量多于40%丝素蛋白组;在共培养第5天,50%丝素蛋白组细胞分泌的ALP含量高于40%丝素蛋白组。结论： 质量比为1 ∶1的丝素蛋白壳聚糖支架孔隙结构规则,最适合成骨细胞MG-63的黏附、增殖。     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖骨组织工程支架的制备及性能评价

目的探寻新型脱细胞骨基质（Acellular Bone Extracellular Matrix,ABECM）材料及脱细胞骨基质-壳聚糖（Chitosan,CS）复合多孔支架的制备方法,并对其性能进行评价。方法采用Triton X-100、十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate,SDS）的脱细胞方法对猪股骨进行脱细胞处理,应用溶液共混、冷冻干燥法制备脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架。对ABECM材料进行定性分析,观察ABECM-CS复合多孔支架的形态学、孔隙率、力学性能和细胞-支架复合培养的相容性。结果 ABECM材料HE染色、Hoechest33258荧光染色均无细胞残留,茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、骨形态发生蛋白-2抗体染色阳性。扫描电镜显示支架具有多孔结构,孔径50-200μm,孔隙率为（53.50±4.23）%,力学测试支架干燥状态纵向压缩模量为（33.23±14.45）MPa,支架湿润状态下的压缩模量为（2.27±1.13）MPa。细胞-支架复合培养相容性良好。结论制备的ABECM-CS复合多孔支架去细胞彻底,保留了脱细胞骨基质主要成分,具备合适的孔径和孔隙率,细胞相容性良好,是理想的骨组织工程支架。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

动态培养对骨髓间充质干细胞在三维多孔支架中成骨分化的影响

目的  研究动态培养条件下人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中的成骨状况。方法  从人骨髓中分离间充质干细胞进行体外培养扩增,将第3代细胞与多孔β-磷酸三钙支架复合。对细胞/支架复合体进行动态灌注培养（动态培养组）以及静态培养（静态培养组）,28d后采用MTT法检测三维支架中细胞的增殖,通过p-磷酸硝基苯法检测碱性磷酸酶活性,以及应用ELISA方法检测培养过程中骨桥蛋白及骨钙素的分泌。同时对培养后的细胞/支架复合体进行电镜观察及组织学检测,观察人骨髓间充质干细胞形成矿化细胞外基质的能力。结果  培养28d后,动态培养组细胞增殖及ALP活性显著高于静态培养组（P<0.05）。整个培养过程中,动态培养组骨桥蛋白及骨钙素的分泌高于静态培养组。静态培养组中细胞仅在多孔支架周缘增殖,而动态培养组中细胞则在整个支架内增殖。另外,动态培养组支架中形成的组织及新生骨明显多于静态培养组（P<0.05）。结论  动态培养有利于人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中增殖并向成骨方向分化。     

低渗作用对人成骨样细胞MG63功能的影响

目的 本试验通过研究低渗透压的静牵张作用对成骨样细胞MG63的增殖能力、碱性磷酸酶活性以及[Ca2 ]i的影响,探讨该应力形式下成骨样细胞MG63的力学响应特征.方法 用不同渗透压的低渗透液,对成骨样细胞MG63分别进行2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h持续牵张作用后,用MTT法检测细胞增殖情况,用ALP试剂盒检测ALP活性的变化,用钙试剂盒检测[Ca2 ]i含量波动情况.结果 随着作用时间的延长,成骨样细胞MG63在277 mmol/L和240 mmol/L低渗透液的持续性膨胀作用下,其细胞增殖能力增强,[Ca2 ]i、ALP活性缓慢增高;而细胞在163 mmol/L低渗液作用下,细胞增殖受到抑制,8 h时出现[Ca2 ]i急剧升高,ALP活性明显高于其对照组.结论 低渗膨胀对MG63的增殖分化、ALP活性以及Ca2 -ATPase都有一定的影响作用,且Ca2 内流与ALP活性之间存在一定的相关性.     

新型多级孔生物玻璃对人成骨细胞增殖和分化的促进作用

目的：探讨一种新型的以地中海海绵为模板合成的多级孔生物玻璃（MBG）对人源性成骨样细胞系MG63增殖和分化的影响,阐明该生物活性玻璃的成骨分化作用。方法：扫描电镜观察MBG材料孔架结构;取对数生长期MG63细胞分别给予MBG浸提液（MBG组）、普通生物玻璃（NBG组）和空白培养基（空白对照组）,共培养1、3和5 d。MTT法检测各组MG63细胞的增殖率,酶联免疫法检测MG63细胞中碱性磷酸酶（ALP）的活性,实时定量PCR法检测培养24h时各组MG63细胞中成骨相关基因Sp7mRNA及Runx2mRNA的相对表达水平。结果：扫描电镜下观察,MBG为多孔支培养架结构;培养1、3和5d时MBG组MG63细胞增殖率高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;1、3和5d时,MBG组MG63细胞中ALP活性高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;培养24h后MBG组MG63细胞中Sp7 mRNA相对表达水平高于（P<0.01）,但Runx2 mRNA相对表达水平与空白对照组和NBG组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：与NBG比较,该新型MBG具有细胞毒性小和可促进成骨细胞分化的优势。     

MMT法评价多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的细胞毒性

目的制备多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖（nHA/CS）,对其进行细胞毒性检测。方法采用共沉淀法和粒子沥滤法制备多孔nHA/CS。分离培养大鼠成骨细胞,碱性磷酸酶（ALP）染色进行成骨细胞进行鉴定,倒置显微镜下观察培养过程中细胞的形态和增殖情况。MTT检测多孔nHA/CS支架材料对成骨细胞增殖的影响,评价细胞毒性。结果细胞可在多孔nHA/CS周围贴壁生长,并且附着、增殖,其生长及功能不受抑制。结论多孔nHA/CS无细胞毒性,有利于细胞的黏附和增殖,可以用于骨组织工程支架材料。     

PLGA/CPC支架材料复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的体外效果评价

目的：探讨聚乳酸聚羟基乙酸/磷酸钙骨水泥(PLGA/CPC)复合骨髓基质干细胞（BMSCs）构建组织工程骨的可行性,为预防剩余牙槽嵴萎缩和促进骨再生提供科学理论指导。方法：采用溶剂浇铸-粒子沥滤技术结合相分离法制备PLGA/CPC支架材料;体外分离、培养、纯化大鼠BMSCs;第3代BMSCs经Dil染色后接种于复合支架材料。实验分为实验组（PLGA/CPC +BMSCs）和对照组（单纯BMSCs）。扫描电镜和激光共聚焦观察支架材料的孔隙率及BMSCs在支架上的黏附情况;CCK-8和碱性磷酸酶(AKP)法检测2组细胞增殖和分化。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均为200~300 μm,支架材料与细胞黏附性较好;原代BMSCs前3 d增殖较慢,3～6 d增殖较快,6 d后增殖较慢;BMSCs表面抗原CD44和CD105均呈阳性表达;茜素红和Ⅰ型胶原染色,BMSCs有良好的成骨活性;Dil染色,细胞标记率达90%以上,标记物对细胞形态无明显影响。CCK-8和AKP法检测,实验组和对照组BMSCs增殖率和AKP活性差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PLGA/CPC是理想的组织工程支架材料。     

壳聚糖-β-磷酸三钙复合层状支架的制备与研究

目的 通过合成壳聚糖-β-磷酸三钙(CS-β-TCP)支架,测试其力学性能、生物相容性和体外成骨向分化能力,研究其作为生物支架修复骨缺损的可能性。方法 通过双向冻干技术制备CS-β-TCP支架,使用扫描电子显微镜电镜(SEM)、能量分散光谱(EDS)和X线衍射仪(XRD)对该支架进行结构表征、元素分布和组成成分分析,力学万能仪测试其压缩强度。通过CCK-8法和活死染色探究其生物相容性,采用荧光染色法检测复合组(CS-β-TCP)支架的细胞黏附生长情况。qRT-PCR法检测成骨相关基因：骨形态发生蛋白(BMP2),RUNX相关转录因子2(RUNX2)和Ⅰ型胶原(COL1)的表达,ALP染色检测BMSCs的成骨分化效果。结果 扫描电镜结果显示CS-β-TCP支架呈平行排列的薄层状结构,疏松多孔,β-TCP颗粒均匀的分布在壳聚糖骨架上,具有良好的机械性能,CS-β-TCP支架的CCK-8结果与对照组无明显差异,活死染色结果表明复合组支架上细胞具有较高的细胞活性。qRT-PCR和ALP结果表明复合组支架体外具有一定的骨诱导能力,能够促进间充质干细胞的成骨向分化。结论 复合组支架具备优异的机械性...     

Inhibitory effects of PIN1 antisense gene on the proliferation of human osteosarcoma cells

INTRODUCTION Phosphorylationofproteinsonserineorthreonineresiducesprecedingproline(Ser Thr pro)isama jorintracellularsignalingmechanism.Recentworkindi catesasthefirststep,thephosphorylatedSer Thr pro motifsmustbeisomerizedspecificallybythepeptidyl prolylcis transisomerasePIN1.Thispost phosphoryla tionisomerizationcanleadtocomformationalchangesin thesubstrateproteinsandmodulatetheirfunctions[13].PIN1interactswithmorethan20mitoticphosphoproteins andplaysacriticalroleinoncogenesissuchascy…     

壳聚糖-胶原支架与人牙周膜细胞复合培养的实验研究

目的 对不同比例的壳聚糖-胶原（chi—col）进行细胞相容性和细胞毒性的研究,以初步探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法 将体外培养的人牙周膜细胞（PDLCs）接种于不同比例的chi—col上复合培养,采用细胞计数评价PDLCs在clli—col上的附着、生长情况,并通过MTF测试法和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法研究chi—col浸提液对PDLCs增殖和功能表达的影响。结果 人PDLCs在chi—col上形成良好贴附并增殖,而PDLCs在不同浓度的材料浸提液中的生长、增殖及ALP活性与对照组相比无统计学意义。结论 clli—col具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望成为牙周组织工程的支架材料。     

不锈钢微粒对人成骨样细胞毒性及护骨素及其配体基因表达的影响

目的评价两种不锈钢微粒（镍铬和钴铬合金）对人成骨样细胞MG-63的细胞毒性及对人成骨样细胞分泌护骨素（OPG）、核因子kB配体受体激活子（RANKL）的影响。方法选择人成骨样细胞系MG-63作为细胞毒性的实验对象,干预材料选用镍铬、钴铬合金微粒,使二者均以0.005%、0.01%和0.05%三个终浓度作用于细胞48 h;并设立对照组。MMT法检测细胞活力,评价不锈钢种植体的细胞毒性;用半定量RT-PCR检测人成骨样细胞内OPG/RANKL mRNA的表达量,分析微粒对破骨细胞重要信号传导通路OPG/RANKL/RANK系统的影响。结果 （1）与对照组比较,当镍铬粒子浓度〉0.01%时,对细胞生长产生一定的抑制作用;而钴铬对人成骨样细胞的生长无明显的抑制作用。（2）与对照组比较,镍铬粒子浓度〈0.01%时,对造骨细胞OPG的表达无明显影响,但可以诱导人成骨样细胞中RANKL的表达;钴铬粒子对细胞OPG表达无明显的影响,只有当粒子浓度达到0.05%的时候,才对人成骨样细胞中RANKL有一定的诱导效果。结论不锈钢微粒对人成骨样细胞无细胞毒性;低浓度不会促进人成骨样细胞的增殖、分化及抑制破骨细胞的形成。     

不同交联剂处理对脱细胞小肠黏膜下层多孔支架的影响

目的: 探讨不同交联剂处理对脱细胞小肠黏膜下层(decellularized small intestinal submucosa, SIS)多孔支架理化性能及生物相容性的影响。方法: (1) 将新鲜SIS塑形为三维多孔支架并采用戊二醛(glutaraldehyde, GA)、碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC]和原花青素(procyanidine, PA)3种交联剂进行交联, 获得3组交联后支架, 分别为GA组、EDC组和PA组。(2)理化性能评价: 对3组多孔支架进行宏观形貌观察, 使用场发射环境扫描电镜进行微观形貌观察并测定孔径及孔隙率, 使用茚三酮法测定交联度, 使用酶促降解法评价抗降解性能, 使用万能力学测试机测定应力应变曲线及压缩强度。(3)生物相容性评价: 使用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)法检测交联处理对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)增殖的影响, 使用Calcein-AM/PI活死细胞染色法评价交联处理后支架的细胞毒性。结果: 宏观形貌观察可见交联修饰未破坏支架三维结构; 微观形貌观察可见各组多孔支架具有大小均匀、相互连通的孔隙结构。EDC组孔径最大, 与另两组差异具有统计学意义(P < 0.05);PA组孔隙率最低, 与另两组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。PA组交联度最高而溶胀率最低, EDC组溶胀率最高。EDC组和GA组的体外降解速率均高于PA组, 其中GA组降解速度最快, PA组抗降解能力最佳, 降解至第15天时3组质量丧失率间的差异有统计学意义(P < 0.05)。EDC组和GA组压缩强度近似, PA组压缩强度最高, 与另两组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。GA组支架的细胞毒性最大, hBMSCs在EDC组和PA组支架上具有更好的增殖能力, 在GA组增殖较慢。结论: 3种交联剂处理均可达到较高的交联度, 经EDC和PA交联处理的SIS多孔支架在拥有较好理化性能的同时具有良好的生物相容性, 相比于GA是更有应用前景的交联处理方法。     

旋转式动态三维培养结合可控管道结构支架体外节段性骨的构建

目的探讨应用可控管道结构支架接种成骨细胞并行旋转式动态三维培养作为一种新的节段性组织工程骨体外构建方法的可行性、效果和机制。方法设计、制备可控管道结构自固化磷酸钙（CPC）支架,并设计开发新型旋转式生物反应器。分离、扩增兔颅骨成骨细胞接种支架后分别行旋转培养和静态培养7、14、21d后,行四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、细胞葡萄糖日耗量、细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的检测及扫描电镜（SEM）观察、X射线能谱（EDX）分析。结果旋转培养组细胞的增殖、代谢、成骨分化等均显著优于静态培养（F=144．187、F=491．603、F=34．913,均P〈0．01、P〈0．01）;旋转培养组细胞支架内分布的均匀性优于静态培养,EDX分析显示细胞分泌磷酸钙基质。结论可控管道结构CPC支架结合旋转式动态三维培养有效促进成骨细胞的增殖、代谢、分化和支架内合理分布,可成为一种新的节段性组织工程骨体外构建方法。     

Fabrication and Evaluation of Porous Keratin/chitosan (KCS) Scaffolds for Effectively Accelerating Wound Healing*

ObjectiveTo develop a dressing with desired antibacterial activity, good water maintaining ability and mechanical properties for wound healing and skin regeneration. MethodsThe chitosan with different concentrations were added in keratin solution to form porous keratin/chitosan (KCS) scaffolds. The morphological characteristics, chemical composition, wettability, porosity, swelling ratio and degradation of the scaffolds were evaluated. The antibacterial activity was tested by usingS. aureusandE. colisuspension for 2 h. And L929 fibroblast cells culture was used to evaluate the cytotoxicity of the KCS scaffolds. ResultsThe adding of chitosan could increase the hydrophobicity, decrease porosity, swelling ratio and degradation rate of the KCS porous scaffolds.Mechanical properties of KCS scaffolds could be enhanced and well adjusted by chitosan. KCS scaffolds could obviously decrease bacteria number.The proliferation of fibroblast cells in porous KCS patch increased firstly and then decreased with the increase of chitosan concentration. It was appropriate to add 400 μg/mL chitosan to form porous KCS scaffold for achieving best cell attachment and proliferation compared with other samples. ConclusionThe porous KCS scaffold may be used as implanted scaffold materials forpromoting wound healing and skinregeneration.     

多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞三维复合体的构建

目的:探索用多孔β-磷酸三钙/胶原(β-TCP/col)支架与犬牙周膜细胞(PDLCs)在体外构建三维复合体.方法:分离培养犬PDLCs,并对其来源进行鉴定;利用甲基噻唑基四唑法检测β-TCP/col浸提液对PDLCs增殖的影响;并将第3代PDLCs以2×10⁵/mL的浓度接种于β-TCP/col支架上进行三维复合体的体外构建,用扫描电镜观察.结果:β-TCP/col浸提液对犬PDLCs增殖无不良影响;PDLCs可在材料的三维结构上贴附生长,细胞充分伸展,且表面可见明显分泌物. 结论:多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞具有良好的生物相容性,二者可在体外构建成三维复合体,提示该材料具有成为牙周组织工程理想支架材料的潜力.