rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的原核表达载体,并在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达可溶性的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ。以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经ＮｃｏⅠ／Ｎｏｔ Ⅰ酶切鉴定,该ＳｃＦｖ基因由７５０ｂｐ组成。将其亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ表达载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取质粒进行ＤＮＡ序列测定,符合ＳｃＦｖ的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。ＩＰＴＧ诱导转化的大肠杆菌ＪＭ１０９,在其培养上清中获得了可溶性ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ的表达。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证实表达的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡ     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

CFA—I重组克隆定居因子菌毛抗原的纯化及形态学观察

用基因重组技术获得的高效表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原Ⅰ（ＣＦＡ／Ⅰ）的重组克隆，通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析部分纯化，再经超速离心及ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０柱层析，得到了ＣＦＡ／Ⅰ的纯化样品，得率约为０．９ｍｇ／ｇ湿菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）显示一条蛋白质带，其分子量为１５ｋＤａ，与天然ＣＦＡ／Ⅰ相同。免疫扩散和蛋白质印迹试验证明，纯化的重组克隆ＣＦＡ／Ⅰ与天然ＣＦＡ／     

人脑源性神经营养因子及神经营养素—3重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建人脑源性神经营养因子和神经营养素－３重组腺病毒，使其携带神经营养因子感染神经系统细胞，在局部释放有生物活性的营养因子。方法：Ｕ针人全长ＢＤＮＦ与ＮＴ３基因分别插入ｐＣＤＮＡ３载体，然后将表达序列ＣＭＶ－ＢＤＮＦ－ＢＧＨｐＡ和ＣＭＶ－ＮＴ３－ＢＧＨｐＡ切下，插入Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＨΔＥｌｓｐ１Ａ中，与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞，通过同源重组产生重组腺病毒。结果和结论：经过二次ＣｓＣｌ     

基因重组干扰素γ对骨髓增生异常综合征

用基因重组干扰素（ＩＦＮ－γ）对４１例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）病人造血祖细胞的作用进行了体外观察，结果：①ＩＦＮ－γ体外对非血液病对照组病人的红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ）和粒系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）无明显促增殖作用，而对ＭＤＳ病人的ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ有明显促增殖作用。其作用呈剂量依赖型，在ＩＵ／ｍｌ时作用最小，１００Ｕ／ｍｌ时作用最强；②ＩＦＮ－γ对ＭＤＳ原ＣＦＵＥ和ＣＦＵ－ＧＭ增殖正常组加入ＩＦＮ－γ后集落数增加最明显，而对增殖明显减低组集落数无明显增加；③ＩＦＮ－γ对ＭＤＳ不同亚型病人ＣＦＵＥ和ＣＦＵ－ＧＭ作用不同，其中对转化中原始细胞增多的难治性贫血（ＲＡＥＢ－Ｔ）型病人有效率较高。     

CFA／Ⅰ重组克隆定居因子菌毛抗原的纯化及形态学观察

用基因重组技术获得的高效表达肠毒素大肠杆菌定居日子抗原Ⅰ（ＣＦＡ／Ⅰ）的重组克隆，通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析部分纯化，再经超速离心及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０柱层析，得到了ＣＰＡ／Ⅰ的纯化样品，得率约为０．９ｍｇ／ｇ湿菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）显示一条蛋白质带，其分子量为１５ｋＤａ，与天然ＣＦＡ／Ⅰ相同。免疫扩散和蛋白质印迹试验证明，纯化的重组克隆ＣＦＡ／Ⅰ与天然ＣＦＡ／Ⅰ具有相同的抗原性及免疫原性。并在电镜下观察了ＣＦＡ／Ⅰ的菌毛形态。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反