血小板生成素基因注射促血小板生成作用的实验研究

本文研究了 ＴＰＯ 基因注射法对健康小鼠血小板的促生成效果。将带有 ＴＰＯ ｃＤＮＡ 的ｐｃＤＮＡ３ 质粒按６０μｇ／只剂量注射到昆明小鼠后肢内侧肌肉内，每天断尾采血，对白细胞和血小板计数。一定时间内采股骨骨髓推片，计数单位面积内的巨核细胞数。以同期未注射的小鼠作为对照组。结果显示，在基因注入后的第三天起即出现血小板和巨核细胞增多。在所观察的三周内，血小板有一可持续一周的高水平期，平均约为同期对照的１８４％ ，最高可达三倍以上。计数高峰后血小板计数在高于对照水平上呈波动状态。小鼠脾脏出现以巨细胞增生和内皮细胞活化为特点的组织学变化，提示ＴＰＯ 具有刺激免疫功能的作用     

血小板生成素过量表达对T淋巴细胞增殖和分化的影响

目的　探讨ＴＰＯ（血小板生成素）基因导入对Ｔ 细胞增殖和分化影响的规律。　方法　将编码人ＴＰＯ 的质粒６０μｇ 用脂质体包裹后，经肌肉途径转导入Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠体内。用ＣＤ４和ＣＤ８的特异性抗体标记小鼠各种免疫组织中的Ｔ 细胞，借助流式细胞术分析它们的组成和变化。　结果　发现ＴＰＯ 基因导入使（１）骨髓中的成熟和未成熟Ｔ 细胞数量在经过短期下降后全部大幅度增多；（２）胸腺未成熟Ｔ细胞增加；（３）脾脏和血液循环中成熟Ｔ 细胞增多，特别是在血液中ＣＤ４阳性细胞的增加最为明显。这些特点大约在基因导入后两周内形成，并持续至少两周以上。　结论　提示ＴＰＯ 是一种免疫促进分子，ＴＰＯ 基因导入后小鼠血液中多种淋巴因子的升高与它过量表达对Ｔ 细胞的刺激有关。     

血小板生成素基因治疗的研究

血小板生成素（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ），又称巨核细胞生长发育因子，能特异性地作用于巨核细胞增殖和分化阶段［１］。研究表明，当向正常动物供以重组蛋白ＴＰＯ时，能明显提高动物体内血小板计数［２］。这一发现为治疗那些由于接受高剂量化疗和放疗而遭受生命危险的血小板减少症病人提供了可能性。鉴于重组ＴＰＯ对病人来说属外源蛋白，具有不同程度的副作用，本文以基因治疗技术探索一条新的ＴＰＯ给药途径，即把基因导入动物体内，使动物自身表达ＴＰＯ，维持高水平血小板。１　材料与方法１．１　质粒　本室利用ＲＴ…     

血小板生成素N端结构或全长分子的生物学活性分析

以构建的人血小板生成素（ＴＰＯ）真核和原核表达质粒为基础，对其表达产物即ＴＰＯ全长分子及以融合蛋白形式表达的ＴＰＯＮ端结构域，通过给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔注射进行了生物活学性分析，结果表明，两种蛋白均具有明显促进血小板生成的作用，为进一步研究ＴＰＯ的糖基化与其生物学活性及半衰期关系打下基础。     

血小板生成素N端结构域及全长分子的生物学活性分析

以构建的人血小板生成素（ＴＰＯ）真核和原核表达质粒为基础，对其表达产物即ＴＰＯ全长分子及以融合蛋白形式表达的人ＴＰＯＮ端结构域，通过给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔注射进行了生物活学性分析。结果表明，两种蛋白均具有明显促进血小板生成的作用。为进一步研究ＴＰＯ的糖基化与其生物学活性及半衰期关系打下基础。     

人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达

目的：人血小板生成素（ＴＰＯ）在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用ＰＣＲ技术,扩增出了（１－１７４个氨基酸的）人血小板生成素ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定。表达产物ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的（１－１７４氨基酸）ＴＰＯｃＤＮＡ片段;表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相对分子质量     

免疫因子对血小板生成素的负调节作用

鉴于ＴＰＯ 在体内长期表达会给机体带来一些负面影响，以及在较长期作用模式下，机体血小板的生成能力与ＴＰＯ 在体内水平的不一致，本文对免疫因子与ＴＰＯ 表达及其生物活性间的关系进行了研究。在ＴＰＯ ｃＤＮＡ 转移到体内后，血液中ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－ α和ＩＬ－２ 迅速升高。其中，ＩＦＮ－γ与血小板计数呈明显负相关， 在血小板计数回落后保持在对照水平的 ９～１２ 倍；ＴＮＦ－α仅在第 １ 周内与之成正相关，且可达对照水平的１２０ 倍，此后局限于对照水平；ＩＬ－２ 升高幅度较小，与ＴＰＯ 的变化相一致。另外，血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与ＩＬ－２ 的变化类似；而Ⅰ型分子与ＴＮＦ－ α的变化相似。结合基因转移后的组织学特点，可以认为ＩＦＮ－γ在血小板生成过程中起主要的逆向调节作用，而机体出现了以巨噬细胞、内皮细胞和Ｔ 淋巴细胞活化为特点的免疫学改变     

rhTPO的克隆及其在原核细胞中的表达

为了更加简便有效地得到重组人血小板生长因子（ｒｈＴＰＯ），以治疗放射及化学药物等所致骨髓损伤造成的血小板减少与缺乏，缓解临床上的出血症状，降低死亡率。方法本实验从６月龄人胚胎肝脏细胞中分离ｍＲＮＡ，设计合成特异性引物，经逆转录，套式ＰＣＲ等步骤克隆出了人ＴＰＯ全基因。将人ＴＰＯ基因亚克隆至原核细胞表达载体ｐＢＶ２２０，形成了重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＴＰＯ，以该重组质粒转化了原核细胞大肠杆菌ＤＨ５α，应用４２℃热诱导表达目的蛋白。结果经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到了ＴＰＯ在原核细胞中的表达，其分子量与目的一致。结论ｈＴＰＯ可以在原核细胞得到良好的表达，为临床血小板减少症的生物治疗奠定了基础。     

低剂量辐射对环磷酰胺所致DNA损伤的影响

目的研究低剂量γ射线预照射对大剂量环磷酰胺化疗所致外周血淋巴细胞DNA损伤及遗传物质损伤的影响。方法昆明种雄性小鼠随机分为空白对照组、荷瘤对照组（假照组）、荷瘤低剂量照射组（LDR组）、荷瘤环磷酰胺化疗组（CTX组）和荷瘤低剂量照射联合化疗组（LDR＋CTX组）。常规饲养1周后，于左腹股沟皮下各接种S180肉瘤细胞（空白对照组除外），接种后第8和11天对LDR组和LDR＋CTX组小鼠给予75mGy-γ射线全身照射，照射后30h分别给予CTX组和LDR＋CTX组小鼠腹腔注射环磷酰胺3．0mg；第13天处死所有小鼠，分别取血，采用单细胞凝胶电泳法检测外周血淋巴细胞DNA损伤；采用骨髓嗜多染红细胞微核率（MNF）检测遗传物质损伤。结果①环磷酰胺化疗后DNA损伤程度较空白对照及荷瘤对照组均显著增加；环磷酰胺化疗前给予75mGy-γ射线照射，则可显著降低大剂量环磷酰胺化疗所致的DNA损伤。②大剂量环磷酰胺化疗后小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率较空白对照组及单纯荷瘤组有显著增加（P〈0．01）；环磷酰胺化疗前给予75mGy-γ射线照射则可降低环磷酰胺所致微核率的增加，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论①大剂量环磷酰胺化疗可引起外周血淋巴细胞DNA损伤；化疗前给予75mGy-γ射线照射对DNA损伤可能产生一定的保护作用。②环磷酰胺有强大的致突变作用，可导致骨髓嗜多染红细胞微核率显著增加，75mGy-γ射线预照射对大剂量环磷酰胺化疗的遗传学毒性未表现出明显的保护作用。     

rhTPO 对60Co 照射小鼠造血系统影响的研究

目的为了检测ＴＰＯ的体内活性及其对血小板减少的治疗作用，寻找用以治疗辐射及化学药物等所致骨髓损伤造成的血小板减少与缺乏，缓解临床上的出血症状，降低死亡率的一种新途径。方法本实验应用基因工程的方法重组了人的ＴＰＯ，取昆明种正常雄性，经一次５．０Ｇｙ６０Ｃｏγ射线全身照射小白鼠为动物模型，通过对外周血血象的观察，及小鼠骨髓造血祖细胞培养的检测，研究了ｒｈＴＰＯ在体内对６０Ｃｏ全身照射处理小鼠的造血系统的影响。结果实验表明，ｒｈＴＰＯ能够减轻照射对小鼠外周血血小板及骨髓造血祖细胞中巨核系祖细胞的影响，并有促进其早期恢复的作用，且这种作用是量效相关的。结论提示，ＴＰＯ是巨核细胞系统较特异的正调控因子，具有促进巨核细胞增殖发育和刺激血小板生成的作用，是临床治疗骨髓组织损伤引起的血小板减少和缺乏及贫血的有希望的生物治疗药物。     

PSP94—TNFαD11a质粒DNA注射体内表达规律

将带有目的基因PSP94－TNFαD11a的pcDNA3.0质粒DNA，以50μg／只剂量注射到39只雄性昆明小鼠的股四头肌内，第2、3、4、5、10、15、20、25天分别摘眼球取血收集血清，每组3只动物血清混合。同时取注射部位骨骼肌，研磨后离心取上清。用ELSIA方法检测血甭和骨骼骨上清中融合蛋白的表达，观察不同时间的蛋白表达水平。提取14天骨骼肌组织的总RNA，进行RT－PCR分析目的的基因mRNA的表达水平。结果，在裸质粒注射后9天可检出目的蛋白的表达，第14天出现表达高峰，观察至25天仍可检察到蛋白表达。     

核酶阻断per1表达对吗啡成瘾小鼠海马c-fos转录及表达的影响

目的研究用特异性核酶阻断生物节律基因per1的表达对吗啡成瘾小鼠海马c—fos基因转录及表达的影响。方法制备吗啡成瘾小鼠模型，向小鼠脑室内注射脂质体包裹的重组质粒pcDNA3．1-per1RZ DNA，在脑内产生特异性核酶-per1RZ，阻断小鼠脑内生物节律基因per1的表达。作脑组织冰冻切片，用原位杂交和免疫组化法测定小鼠海马c—fos基因转录及表达的变化。结果per1RZ能使吗啡成瘾小鼠海马的c—fos基因转录及表达明显减弱。结论重组质粒表达的per1RZ可以干扰生物节律基因per1的表达，抑制海马c—fos基因的转录和表达，从而控制吗啡成瘾的发生。     

血管内皮生长因子转基因治疗小鼠辐射损伤的实验研究

目的 通过构建血管内皮生长因子(VEGF)基因的真核表达质粒,并将其转入受照小鼠机体,研究VEGF蛋白表达对放射损伤的救治作用及其分子机制。方法 昆明种小鼠通过随机化分组表法随机分为正常对照组、单纯照射组和转基因组。转基因组应用VEGF重组质粒进行肌肉注射,注射后24 h接受8 Gy X射线照射,进行小鼠临床表现和死亡率观察。并于照后不同时间处死动物,进行组织器官病理学和原位胸腺和脾细胞凋亡检测。结果 用PCR方法从pSP73/H_VEGF165质粒扩增得到VEGF₁₆₅基因片段,经双酶切后与酶切的pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,经电泳和测序表明序列与GeneBank完全一致。X射线8 Gy照射小鼠,单纯照射组14 d内死亡率为64%,而转基因组为36%,两组比较差异有统计学意义(t=3.92,P＜0.05)。转基因组小鼠胸腺和脾组织的细胞凋亡率显著降低(t=3.11、3.53,P＜0.05),放射病理损伤明显改善。结论 成功构建了重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,重组质粒转基因治疗可显著降低严重辐射损伤小鼠的死亡率,显著减低胸腺和脾脏细胞凋亡率,明显改善免疫器官的病理变化。     

脂质体介导内皮抑素基因治疗对裸鼠人子宫内膜异位症的作用

目的 探讨脂质体介导内皮抑素(ES)基因治疗裸鼠人子宫内膜异位症(EMs)的疗效及不良反应.方法 BALB/c雌性裸鼠40只,建立皮下EMs模型后将动物随机均分为4组(n=10):A组,病灶局部注射脂质体介导的pcDNA3.1(+)-hES 20μg;B组,肌内注射脂质体介导的pcDNA3.1(+)-hES 20μg;C组,病灶局部注射脂质体介导的pcDNA3.1(+)空质粒20μg;D组,病灶局部注射等量培养液.观察治疗21d后裸鼠皮下异位病灶生长情况,检测病灶内微血管密度(MVD)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白及治疗后第3、7天时VEGF mRNA的表达情况,并计算治疗21d后内生殖器(子宫、卵巢)重量及与体重的比值.结果 A、B、C、D组病灶生长倍增时间分别是7.49、7.02、6.67、6.15d;A、B组注射ES基因后病灶生长抑制率分别为90.51%、43.05%.治疗21d后,A组MVD值(32土10/mm~2)较B组(56±14/mm~2)、C组(82±19/mm~2)、D组(82士19/mm~2)明显减少(P<0.05),后三组间差异无统计学意义,四组间VEGF表达水平差异无统计学意义(P>O.05).与C、D组比较,A组在治疗第3天VFGF mRNA明显下降,第7天显著回升,而B组变化不明显.A、B组的内生殖器与体重比值(分别为0.008 6±0.002 5、0.008 O士0.003 4)较C、D组(分别为0.011 6士0.014 0、0.012 0士0.023 0)明显下降(P<0.05).结论 20μg脂质体介导pcDNA3.1(+)-hES治疗裸鼠人EMs有效,但须注意其对子宫、卵巢的影响.     

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

tTSF基因的酵母表达及其基因治疗研究

目的 选择PF4，TSP1的高活性片段及肿瘤细胞靶向肽，设计合成融合基因—tTSF，进行酵母表达及小鼠基因治疗研究。方法 根据PF4和TSP1的抑制血管生成高活性片段设计合成TSF基因，并在N-端接上肿瘤细胞靶向肽，设计合成了tTSF。将tTSF基因构建到pPIC9质粒，重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株进行表达，并检测表达产物对血管内皮细胞生长的抑制作用。将tTSF基因克隆到pcDNA3．1（＋）载体，重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF通过皮下注射治疗C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌。结果 重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株后，获得了tTSF的高效表达，表达产物对血管内皮细胞生长产生明显的抑制作用；皮下注射重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF后，C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌的生长受到明显抑制。结论 tTSF基因设计成功，其酵母表达产物对血管内皮细胞生长产生具有明显的抑制作用，tTSF基因的体内基因治疗也具有显著的抗肿瘤效应。     

胃癌MG7-Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗的构建及其诱导小鼠免疫反应的研究

目的　以热休克蛋白 70 (HSP70 )为载体 ,构建胃癌MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因的DNA疫苗 ,并观察该疫苗诱导C5 7BL/ 6小鼠产生MG7 Ag特异性免疫反应的作用。方法　将胃癌MG7 Ag模拟表位 (九肽 )的编码序列设计在HSP70下游引物的 5′末端 ,通过PCR方法获得HSP70与模拟表位的融合基因片段。将PCR产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+) ,构建融合基因疫苗。将该融合基因疫苗接种C5 7BL/ 6小鼠股四头肌 ,每隔 3周加强免疫一次 ,共接种 3次。分别在每次接种后 3周收集免疫血清 ,用细胞ELISA法检测小鼠血清中抗MG7 Ag抗体的水平。末次免疫后 3周 ,收集脾细胞 ,用51Cr释放法检测MG7 Ag特异性CTL的杀伤活性。结果　PCR扩增得到大小约 2 .0kb的片段 ,与预期大小一致。将该片段克隆入pcDNA3.1(+) ,DNA序列测定证实MG7 Ag模拟表位的编码序列已成功融合于HSP70cDNA的 3′末端。基因疫苗免疫后 ,融合基因免疫组小鼠于第 9周出现抗MG7 Ag抗体 ,而对照组小鼠无MG7 Ag抗体产生 (P <0 0 5 )。51Cr释放实验结果表明 ,融合基因免疫组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率与对照组相比无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗构建成功 ;该融合基因疫苗能够诱导MG7 Ag特异性的体液免疫反应     

AngiostatinK(1-3)裸DNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

探讨ＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）〖ＡＫ（１－３）〗裸ＤＮＡ治疗人脑胶质可行性和作用机制。用脂质体包埋法将ＡＫ（１－３）基因的真表达载体ｐｃＤＮＡ－ＳＡＫ（１－３）注入裸以下ＳＨＧ４４人脑胶质瘤的特点。ＡＫ（１－３）裸ＤＮＡ在荷瘤裸本内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤血管生成能力显著下降,肿瘤生长受到抑制,抑瘤率达４３％。本研究证明,ＡＫ（１－３）裸ＤＮＡ能抑制人脑质瘤生长,为非病毒载体介导的抗血管生     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

抑癌基因p27真核细胞表达质粒的构建

目的：构建抑癌基因P27真核细胞表达质粒，为研究P27在创面修复及瘢痕形成中的分子机制提供物质基础。方法：PCR法从含有P27全长的质粒中合成P27CDNA片段，连接酶连接至PUC19质粒测序，证明PCR产物序列完全正确，限制性酶切PUC19-P27，获得P27cDNA片段，连接酶连接至pcDNA3，克隆出真核表达质粒pcDNA3-P27。结果：PCR合成p27cDNA片段序列正确，凝胶电泳证明己将p27cDNA片段正确克隆到pcDNA3-P27中。结论：成功构建了抑癌基因p27的真核表达载体pcDNA-p27。