人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

人PPARγ2真核表达载体构建及稳定表达细胞株的建立

目的构建人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（human peroxisome proliferator activa-ted receptorγ2,hPPARγ2）真核表达载体并建立稳定表达hPPARγ2的细胞株。方法用RT-PCR扩增hPPARγ2的全长cDNA并构建出pcDNA3.1（＋）/PPARγ2真核表达载体,经核苷酸序列分析证实。真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hPPARγ2转染到HESF细胞,G418筛选,获得稳定表达hPPARγ2的细胞株,检测其在HESF细胞中的表达。结果核苷酸序列测定证实获得hPPARγ2真核表达载体,RT-PCR、间接免疫荧光染色和Western-blot结果显示转染hPPARγ2的细胞株稳定表达hPPARγ2。结论构建了hPPARγ2真核表达载体,并获得稳定表达hPPARγ2的细胞株,为进一步研究hPPARγ2的功能奠定基础。     

人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行West...     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

前白蛋白cDNA的克隆及稳定转染细胞株的建立

建立真核表达重组体pCDNA3.1( )-PA的稳定转染细胞株。以人胚肝组织总RNA为模板通过RT－PCR获取全长PA cDNA。先将该序列克隆到pGEM-T Easy载体，再亚克隆转入pCDNA3.1( )，限制性内切酶消化及DNA序列分析鉴定重组体构建正确后，用脂质体转染技术把它导入Hela细胞，经G418筛选建立稳定转染细胞株，真核表达重组体pCDNA3.1( )-PA构建成功，稳定转染细胞株中有PAcDNA表达。稳定转染细胞株的成功建立为进一步生产PA的基因工程产品奠定基础。     

P16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建pcDNA3/p16真核表达质粒并了解其对肝癌细胞BEL-7404生长的抑制作用.方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3真核表达载体上,并经脂质体介导转染至BEL-7404细胞中.应用MTT法和流式细胞仪分析转染细胞生长情况和细胞周期.结果重组pcDNA3/p16表达质粒构建成功.经pcDNA3/p16转染的BEL-7404细胞生长速度受到明显抑制,且细胞多停滞于G0/G1期.结论重组pcDNA3/p16质粒能在BEL-7404细胞内表达,且能抑制BEL-7404细胞的生长.     

转录因子ETS1 RNA干扰质粒的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,鉴定并建立干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.方法:分别构建3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒(shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3),并将其转染至人胰腺癌PANC-1细胞株,用药物G418筛选出稳定细胞株,Western blot鉴定稳转细胞株中ETS1表达量.结果:3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒转染胰腺癌PANC-1细胞株后,Western blot检测结果显示干扰质粒1(shRNA-1)具有最佳干扰效果.将具有最佳干扰效果的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞株后,经Western blot鉴定相较于对照组稳定细胞株其ETS1表达量明显降低.结论:成功构建了针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,并建立其稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.     

人遗传印记基因PEG10重组真核表达质粒的构建及其在转染细胞株中的表达

目的构建人遗传印记基因PEG10的全长表达基因质粒,观察PEG10的过表达对人正常肝细胞及其非肝脏来源的对照细胞的作用。方法将PEG10基因全长cDNA直接连入真核细胞表达质粒pcDNA3．1hisC中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pcDNA3．1hisC-PEG10转染入人正常肝细胞及其对照细胞,采用RT-PCR、Western blot、MTT、TUNEL等方法分析PEG10基因在正常人肝细胞及其对照细胞中的表达和功能。结果限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建质粒为PEG 10全长表达质粒。该质粒经过稳定筛选后稳定表达于细胞内,促进人肝细胞的生长,抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞没有明显影响。结论PEG10全长表达质粒的构建为进一步研究PEG10基因的效应和机制提供了有利的工具,研究结果显示PEG10基因可以促进人正常胚肝细胞增殖并抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞人胚肾细胞株293细胞没有明显效应。     

大鼠PAX2真核表达质粒构建及瞬时转染肾小管上皮细胞模型建立

目的为进一步研究核转录因子(PAX2)对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据。方法真核表达质粒(PGC-FU)-PAX2真核表达质粒的构建:设计PAX2的引物,PCR法从单侧输尿管结扎大鼠肾脏中扩增出目的片段,酶切后定向连入PGC-FU载体,将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增;通过PCR及基因测序检测其构建的正确性;PGC-FU-PAX2瞬时转染肾小管上皮细胞模型的建立:脂质体转染法将重组质粒转入肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),RT-PCR法、Western blot法分别检测NRK52E细胞PAX2基因、蛋白表达水平,确认PAX2基因的高表达。结果 RT-PCR法成功克隆大鼠PAX2基因,PCR扩增的片段长度为1 294 bp,含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为408 bp,其基因测序结果显示与预期片段大小一致,目的基因与预期基因序列的同源性为100%,说明PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建成功。NRK52E转染的PGC-FU-PAX2质粒能够高表达PAX2,呈现绿色荧光,空载组和对照组NRK52E均未见PAX2高表达。结论成功构建了真核表达载体PGC-FU-PAX2,建立了PAX2高表达肾小管上皮细胞模型,为PAX2对肾小管上皮细胞的转分化作用机制的研究奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒CTL表位基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位基因的真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染细胞系。方法通过生物信息学预测分析的方法得到涵盖HCV不同基因型与小鼠H2复合体的多个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位,串联后人工合成基因序列,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,然后利用脂质体法转染CHO细胞,通过持续G418筛选建立稳定转染细胞株。最后通过荧光显微镜观察、RT-PCR和Western Blot等方法证实多表位基因的表达。结果所构建的含有HCV复合多表位基因的真核表达载体pEGFP-mEpi在CHO细胞中能稳定表达。结论真核表达载体的成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究复合多表位疫苗的基因免疫奠定了基础。     

TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建

目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-BsdV5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确;实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P<0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%,P<0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

人整合素β3亚基编码基因真核表达载体的构建

目的构建人整合素β3亚基金读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合索β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序。结果序列分析表明与基因库中已发布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,成功构建了pcDNA3.1-β3真核表达载体。结论上述结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-β3已被成功构建,并为进一步研究汉坦病毒的病原学及生物学特征提供了基础。     

MAGE-3目的基因真核表达载体的构建

目的构建黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）目的基因真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3.方法用RT-PCR法从肝癌组织制备含BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pcDNA3.1载体上,根据氨苄青霉素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、引物扩增等方法筛选、鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列MAGE-3目的基因进行DNA测序.结果扩增出MAGE-3目的基因;重组质粒pcDNA3.1-MAGE-3中的插入片段经DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较,结果完全一致.结论成功构建了真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3,为肿瘤免疫治疗提供了条件.