用实时定量PCR检测慢性髓系白血病患者的bcr/ablP210融合基因转录本

目的　建立实时定量PCR(RQ PCR)检测慢性髓系白血病(CML)bcr/ablP210融合基因转录本,评价其在CML诊断和微小残留病(MRD)监测中的意义。方法　设计TaqMan探针和引物,建立RQ PCR法对b3a2和ABL阳性模板进行扩增,并检测22例CML患者bcr/ablP210转录本含量。结果　RQ PCR法最低可检测到 10个拷贝 /μl的阳性模板,但重复性较差,而 108 ~102 拷贝 /μl的重复性良好,正常对照无扩增信号。19例初诊CML患者bcr/ablP210转录本绝对含量为 1. 42×102 ~2. 24×105拷贝 /50ng(中位数量 3. 06×104 拷贝 /50ng),ABL纠正后的相对含量为 3% ~687% (中位数 147% )。2例患者骨髓移植后bcr/ablP210转录本下降, 1例患者由慢性期进展为加速期时含量显著增高。结论　RQ PCR方法敏感、可靠,可用于CML患者的诊断和MRD随访监测。     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病miR-125b的表达及临床应用

目的 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中微小RNA-125b(microRNA-125b,miR-125b)转录本含量,初步评价其在AML临床诊断中的意义. 方法 建立扩增miR-125b转录本的SYBR Green I染料法qPCR,对miR-125b转录本克隆质粒进行扩增,评价其在AML诊断中的特异性、重复性和灵敏性.并对69例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测并评价其临床相关性. 结果 该方法能定量检测骨髓标本中miR-125b的表达水平,熔解曲线呈单峰,在108～ 103 copies/μL范围内有良好的线性关系(R2=0.999)并且检测重复性良好.结果显示69例AML患者中miR-125b表达水平明显高于25例对照组,差异有显著统计学意义(P=0.001).在初发AML的不同亚型中,M3型的miR-125b表达水平高于其他亚型,差异有统计学意义(P＜0.05).miR-125b表达水平与非M3型AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型、核型分组之间均无相关性(P＞0.05).4例初诊AML患者在获得完全缓解后miR-125b表达水平均较治疗前有所降低. 结论 所建立的实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测骨髓单个核细胞标本中miR-125b的表达水平,为进一步临床应用研究奠定了方法学基础.miR-125b异常高表达是AML中的一个常见分子事件,检测其表达可能有助于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测.     

慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

慢性髓系白血病动物模型的研究现状

慢性髓系白血病（CML）的发生发展是机体内正常信号传导网络失衡的结果，它涉及到多个可能的传导通路，借助动物模型来深入阐述CML发生及急变的分子生物学机制是最终治愈CML的突破口。目前建立CML动物模型主要有三种方法，包括转基因法，将bcr-abl阳性细胞移植给同基因小鼠或免疫缺陷小鼠及逆转录病毒载体法。     

慢性髓系白血病动物模型的研究现状

慢性髓系白血病(CML)的发生发展是机体内正常信号传导网络失衡的结果,它涉及到多个可能的传导通路,借助动物模型来深入阐述CML发生及急变的分子生物学机制是最终治愈CML的突破口。目前建立CML动物模型主要有三种方法,包括转基因法,将bcr-abl阳性细胞移植给同基因小鼠或免疫缺陷小鼠及逆转录病毒载体法。     

定量PCR方法监测急性髓系白血病微小残留病的临床意义

随着实时定量PCR方法学的发展,越来越多的医院已将其应用于白血病微小残留病的监测,并且显示出较好的临床价值,但同时也存在许多问题.本文就实时定量PCR监测急性髓系白血病微小残留病的方法以及临床意义等方面的进展进行综述.     

慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义

目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr／abl融合基因定量的临床应用价值。方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr／abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察。结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr／abl融合基因,阳性患者之间19cr／abl表达水平差异很大。常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr／bal表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr／abl表达平均上升了9．06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr／abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr／abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样。结论染色体分析结合bcr／abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

实时定量PCR检测白血病相关miRNA方法的建立

本研究建立实时定量PCR（RQ-PCR）技术检测白血病相关miRNA的方法,探讨此方法在定量检测miRNA中的应用价值。通过提取82例慢性淋巴细胞白血病（CLL）、70例急性白血病（AL）患者骨髓或外周血标本总RNA,以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释,分别作miRNA及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率;运用ABF7300定量PCR仪进行定量检测;采用SYBRGreen荧光染料法、以U6RNA作为内参照、循环阈值（ct）比较法进行miRNA表达相对定量分析,以检测CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181b及AL患者miR．128．1、miR-223、let-7b、miR-155、miR-181a的表达。方法学考核参数包括特异性、线性范围、精密度和重复性。结果表明：RQ—PCR检测miRNA仅需10—50ng总RNA样本,检测下限为0．05ng,miRNA及u6的Ct值均在15—30之间,10倍系列稀释法制作的标准曲线呈现良好的线性关系（R^2〉0．980）,扩增效率均在0．9以上,溶解曲线均为单峰,PCR产物经琼脂糖电泳均显示较亮的目的条带,批内差和批间差分别小于4．8％和6．3％。结论：RQ-PCR技术检测白血病相关miRNA敏感、快速,高通量,节约成本,定量范围宽,极大的方便了对miRNA的定量研究。     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病患者MLL-AF9融合基因表达的预后意义

本研究旨在探讨急性髓系白血病（AML）患者治疗过程中,应用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）检测混合谱系白血病（MLL）的相关融合基因MLL-AF9的基因表达水平及其对监测微小残留病（MRD）的价值。应用RQ-PCR精确地定量检测433例初治AML患者中11例舭L-AF9融合基因阳性患者的表达水平,分析该基因表达水平的变化与临床表现的关系。结果显示：患者MLL-AF9融合基因表达水平初诊时为（1．3-55．28）％;5例单纯化疗患者之中有2例在第1个疗程结束后至第2疗程开始前,该融合基因表达水平〈0．1％,2例全部获得血液学完全缓解且存活;3例MLL-AF9融合基因≥0．1％,均未获得血液学完全缓解且仅1例存活。6例造血干细胞移植患者中,有4例在移植前1个月内该融合基因表达水平〈0．1％,全部患者存活且无复发;2例≥0．1％,均在移植后复发、死亡,且在骨髓细胞形态学复发前1个月内该基因表达水平均≥0．1％。结论：RQ-PCR检测MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的动态变化,与患者的临床预后存在内在相关性,是检测预后的良好指标。此外,RQ-PCR可能有早期检测分子生物学复发的潜力。     

实时定量RT-PCR检测K562/A02细胞株bcr-abl融合基因mRNA水平

本研究定量分析慢性髓系白血病耐阿霉素细胞株K562/A02细胞中bcr-abl融合基因的mRNA水平。收集对数生长期的K562/A02细胞,用TRIzoL提取RNA,用实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)技术检测bcr-abl融合基因及内参基因abl mRNA表达水平。结果表明:RQ-RT-PCR技术分析103-107拷贝数的重复性良好,灵敏度达10-5;K562/A02细胞中bcr-abl融合基因为高表达,bcr-abl mRNA表达量大于100%。结论:实时定量PCR检测K562/A02细胞bcr/abl融合基因mRNA水平,敏感可靠,重复性好,有助于临床辅助监测慢性髓系白血病。     

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病（APL）患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平（拷贝数）进行动态监测。结果表明：用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数（CV）分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA＋化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA＋化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。     

实时定量RT-PCR监测儿童AML患者AML1/ETO融合基因的临床价值

为了探讨实时定量RT-PCR(real-timeRT-PCR)监测儿童AML患者AML1/ETO融合基因的临床价值,筛选出AML1/ETO阳性患儿14例,以连续稀释的AML1/ETO质粒作为标准品建立标准曲线,应用实时定量RT-PCR监测其初治及随访期58份骨髓中AML1/ETO融合基因,用SPSS软件进行统计学分析研究其和临床的关系.结果显示实时定量RT-PCR监测AML1/ETO基因的敏感度可达10-5,重复性好.12份初治标本的AML1/ETOGAPDH比值平均为0.648,该比值与骨髓中幼稚细胞数的比值无相关性.微小残留白血病(MRD)定量水平检测发现,化疗1个月时6例患儿AML1/ETO的量无明显下降(高于5×10-2),其中3例早期复发,1例晚期复发;另4例患儿有明显下降(低于10-2),均长期存活.化疗3个月时5例高于5×10-3者中3例复发;另6例低于5×10-3者中1例复发.6个月后持续高于10-3者3例均复发.MRD定量水平动态检测发现,在化疗中MRD持续在高水平(＞5×10-3)者4例全部临床复发,复发时间在3个月到半年;4例持续低于10-3,维持在10-4-10-6,一直处于骨髓缓解期;1例化疗中从10-5上升到10-3,5个月后临床复发.3例持续缓解超过9个月的患儿仍可检测到融合基因,约10-5-10-6.结论实时定量RT-PCR监测AML1/ETO基因的敏感度高、特异性强、重复性好,大量标本的检测结果可能有临床指导意义.     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

慢性髓系白血病患者移植造血干细胞后bcr／abl融合基因变化的实时定量RT-PCR监测及其意义

为了探讨Ph阳性慢性髓系白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植后不同时期bcr／abl融合基因水平变化的实时定量PCR监测及其意义，对21例CML患者骨髓移植后不同时期bcr／abl融合基因水平用实时定量PCR技术进行了连续监测。结果表明：21例bcr／abl融合基因阳性CML患者移植后7例未检测出融合基因，14例移植后1—6月仍可检出不同水平bcr／ab／融合基因。动态观察发现，9例bcr／abl融合基因处于较低水平，相对数在0．0074％～0．088％，于移植后第3—7月转为阴性。5例符合分子生物学复发标准，融合基因相对数在0．077％-75％。其中1例在骨髓移植后1、2、3个月融合基因相对数分别为0．95％、1．5％、0．16％，于移植后4个月自行转阴性；2例接受同一供者单个核细胞输注后bcr／abl转为阴性；2例发展为临床血液学复发，其中1例经化疗及同供者单个核细胞输注再次缓解，但bcr／abl阳性，另1例不治死亡。结论：对于ph阳性CML患者骨髓移植后连续定量监测bcr／abl融合基因水平可以了解疾病残留状态，预测分子学生物学复发，指导临床治疗，并评价疗效。     

实时荧光定量PCR微卫星分析技术检测少突胶质细胞肿瘤染色体1p、19q和10q杂合性缺失

目的建立检测脑胶质瘤染色体1p、19q和10q杂合性缺失(LOH)的实验室新方法。方法采用Taqman探针法对38例少突胶质细胞肿瘤标本进行染色体1p、19q和10q LOH检测。结果 38例少突胶质细胞肿瘤染色体中有25例(65.7%)发生1p LOH,26例(68.4%)发生19q LOH,5例(13.2%)发生10q LOH。结论实时荧光定量PCR微卫星分析技术快速、准确性高,可以用于脑胶质瘤标本染色体LOH的检测。     

实时荧光定量PCR技术的原理、流程以及应用

实时荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,而被广泛应用于基础研究、疾病研究、肿瘤的诊断等方面,成为分子生物学研究中的重要工具。该文对实时荧光定量PCR技术的原理、检测流程及其应用进行了综述。     

实时定量PCR检测46例初诊急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARαmRNA的分子表达

本研究探讨实时定量PCR（Q-PCR）检测PML／RARα mRNA的方法学，并对46例初诊急性早幼粒细胞白血病（APL）患者骨髓标本进行检测。构建PML／RARα的bcr1型和ber3型转录本以及内参照abl基因转录本的阳性标准品质粒；利用ABI Prism 7500型Q-PCR仪对46例初诊APL患者和40例非APL患者骨髓标本进行检测，PML／RARα mRNA定量结果以校正比值（NQ）表示，NQ=PML／RARα mRNA拷贝数／ABLmRNA拷贝数；应用四色流式细胞术检测免疫表型。结果显示，Q-PCR结果的日间差和日内差平均变异系数（CV）分别为1．58％和0．88％。可重复敏感度为可以检测5 copies／100ng RNA。40例非APL患者PML／RARα mRNA均为阴性。46例初诊APL患者PML／RARα mRNA表达量NQ中位值为0．450（0．084—1．082）。比较32例bcr1型和14例bcr3型两组患者的特征表明，PML／RARα mRNANQ中位值分别为0.454（0.084—1、082）和0．386（0.151—0．848）（P〉0．05）。形态学诊断M3v的患者比例分别为9.40％和48.96％（P〈0.05）；初诊时WBC中位数分别为2．15（0．2—59．6）和9．35（0．91—122．8）（P〈0．05），而在性别、年龄、初诊时血红蛋白和血小板计数、骨髓中APL细胞比例、DIC指标等方面无差异。流式细胞仪术检测时，CD45／SSC射门情况下，APL细胞群分布可以分为两类：高侧向角（L-SSC，粗颗粒）和非高侧向角（NL-SSC，细颗粒）两类。bcr1型患者中85．70％表现为L—SSC，而bcr3型患者中64．29％表现为NL-SSC。结论：建立的Q—PCR方法稳定可靠，敏感度高；berl型和bcr3型APL患者的PML／RARetmRNA表达量无差异，bcr3型APL患者中形态学M3v比例和WBC数比bcr1型患者高；PML／RARα不同转录本类型和免疫表型以及细胞形态学之间有一定的相关性。     

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。     

聚合酶链反应扩增结核杆菌的临床应用

采用PCR技术扩增人型结核分枝杆菌特异的158 bp DNA片段靶基因,检测60例肺结核病人痰标本,结果表明,阳性率达58.3%,对照的常规培养法阳性率为11.7%。20例非结核病患者痰标本两种检测结果均为阴性.研究结果表明,PCR 扩增检测结核杆菌技术比常规检验方法快速敏感,且有较高的特异性。