苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌杀蚊作用以及工程菌改造研究进展

苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌是应用最广泛的杀蚊幼虫的细菌,但还存在很多不足.苏云金芽孢杆菌产生两类杀蚊幼虫晶体蛋白,即内毒素晶体蛋白和溶细胞毒素,球形芽孢杆菌产生二元毒素和杀蚊毒素.研究不同毒素的不同杀蚊作用,以及通过DNA重组技术改造原有的菌种,扩大其杀蚊幼虫的活性和范围,有助于更有效地杀火媒介蚊虫和防治疟疾.     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究 Ⅰ.球形芽孢杆菌毒蛋白基因42的克隆

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片段,通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰,使目的基因片段得以成功克隆。借助光敏生物素核酸标记探针,原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。本实验中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰是ＰＣＲ产物克隆成功的关键     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究：Ⅰ.球形芽孢 …

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片估,通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰,使目的基因片段得以成功克隆,借助光微生物素核酸标记探针,原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。本实验中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰是ＰＣＲ产物克隆成功的关键。     

球形芽孢杆菌在媒介蚊虫防制中作用的研究进展

球形芽孢杆菌是一种非常有前途的生物灭蚊制剂 ,近年来得到广泛研究与应用 ,该文对球形芽孢杆菌的主要杀蚊毒素、二元毒素的作用机制、现场应用效果评价、开发应用前景等作一综述。     

球形芽胞杆菌S层蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆球形芽胞杆菌S层蛋白的编码基因,实现其原核表达并纯化表达产物。方法提取球形芽胞杆菌菌体基因组DNA,根据GenBank公布的核酸序列设计并合成引物,扩增S层蛋白编码基因sllB,与pMD19-T载体连接;测序验证后,构建原核表达质粒pET28a(+)-sllB并转化BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAG和Westernblot鉴定表达产物,亲和柱层析纯化重组蛋白。结果扩增获得S层蛋白编码基因sllB全长(3 306bp),与参考序列同源性为97.5%。构建的原核表达质粒pET28a(+)-sllB转化BL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量为116ku,与理论值相符。Western blot显示其全蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白中均被鼠抗Penta-His抗体识别。结论获得了球形芽胞杆菌S层蛋白编码基因sllB,并实现了其原核表达。     

球形芽孢杆菌对淡色库蚊幼虫的慢性毒理作用的探讨

本文观察了小剂量及亚致死量球形芽孢杆菌2362株对尖音库蚊淡色变种各变态时期的影响,在小剂量和亚致死量处理后,蚊幼虫死亡时间极度分散,于 d3～4出现死亡高峰,其累计死亡率仍高达60—90%,细菌学检查证实,死亡虫体中有大量繁殖的 B·S 毒力株,其菌数为2.61×10~3～3.69×10~4/只。     

苏云金杆菌cryIVD基因的表达及杀蚊毒效测定

目的 研究苏云金杆菌（B.t.i)chIVD基因用于蚊虫生物防治。方法 经IPTG诱导，重组质粒在大肠埃希菌DH5a中进行表达，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹（Wcstern-blot)分析，观察其杀蚊毒效。结果 经SDS-PAGE及 Wcstern-blot分析显示，特异蛋白带的分子质量单位为72ku，并且该蛋白对蚊虫具有杀灭作用。结论 在大肠埃希菌中（B.t.i)chIVD基因单独表达，并具有杀蚊活性。     

水蚤对球形芽孢杆菌灭蚊幼效果的影响

本文结果证明,在蚊虫孳生地中,与蚊幼共存的水蚤是影响B.S灭蚊效果的极为重要的生态限制因子,它可使B.S对蚊幼虫的杀灭率下降30％～50％,使B.S持效明显缩短或消失。细菌学观察证实,水蚤对B.S具有快速的清除作用,B.S暴露于水蚤的生境中,于12hB.S菌数下降86％。这一生态限制因子给B.S的杀虫效果带来严重影响,是B.S应用中亟待解决的问题。     

球形芽孢杆菌C3─41地方制剂大面积防制城市致倦库蚊的现场效果评价

本文报告１９９３年６～１０月，在武汉市水果湖地区应用球形芽孢杆菌Ｃ３─４１地方制剂大规模防制致倦库蚊的现场研究。用３ｍｇ／ｍ２乳剂处理大面积孳生地（大于２ｍ２），每１０ｄ一次，包括水塘、水沟、水槽等；用８ｇ／ｍ２的块剂处理小型容器和积水坑，一月一次。结果表明，幼虫密度下降了７０％～１００％，并能成功的控制成蚊季节性高峰。     

球形芽孢杆菌缓释块剂对蚊幼的毒效试验

本文报道了一种浮于水面，不断释放杀虫剂，适合特殊蚊虫孳生地的球形芽孢杆菌漂浮缓释剂（代号：ＢｓＣ３－４１）．在试验中取得良好杀蚊效果．生物测定结果：ＢｓＣ３－４１块剂对Ⅲ龄致乏库蚊幼虫的ＬＣ５０为０．０１７０ｍｇ／Ｌ。野外试验对三带喙库蚊幼虫最佳剂量为４ｇ／ｍ２，持效期一个月以上。     

苏云金杆菌cryIVD基因的表达及杀蚊毒效测定

目的研究苏云金杆菌(B.t.i)cryIVD基因用于蚊虫生物防治.方法经IPTG诱导,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析,观察其杀蚊毒效.结果经SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异蛋白带的分子质量单位为72 ku,并且该蛋白对蚊虫具有杀灭作用.结论在大肠埃希菌中B.t.i cryIVD基因单独表达,并具有杀蚊活性.     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白的基因克隆与序列分析

本研究根据曼氏血吸虫疫苗候选分子Sm23的基因序列，设计了一对引物，并通过聚合酶链反应（PCR）基因克隆技术，从日本血吸虫中国大陆株cDNA文库中克隆出了中国大陆株23kDa膜蛋白基因。DNA序列分析表明，编码日本血吸虫中国大陆株Sj23膜蛋白的基因含有657bp，与曼氏血吸虫Sm23的核着酸有79．5％的同源性，而与日本血吸虫菲律宾株的Sj23的同源性为100％。该研究为发展Sj23多肽疫苗奠定了基础。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异