实时荧光定量PCR检测人组织因子及其剪切体方法的构建

目的建立检测人组织因子(flTF)及其剪切体(asTF)的实时荧光定量PCR检测技术。方法分别采用文献报导及自行设计的检测人flTF和asTF的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测人flTF和asTF基因。将扩增的人flTF和asTF的基因片段纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含flTF和asTF基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测flTF和asTF基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物分别经测序证实为flTF和asTF的特异性片段。本法检测flTF和asTF基因表达的灵敏度均为40拷贝/μl,线性范围均为4.00×101~4.00×107拷贝/μl,相关系数均为1.000;扩增效率分别为flTF 91.15%,asTF 90.53%,批间变异系数分别为flTF 3.04%~9.31%,asTF 3.01%~9.64%。结论成功建立了检测人flTF和asTF的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高。     

双重实时荧光定量 PCR 检测人维生素 D 受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素 D 受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应 （dual real-time PCR） 的方法。方法 以 GAPDH 基因为内参, 采用 Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物及 TaqMan 探针, 进行 PCR 扩增检测 VDR 基因。将 VDR 及 GAPDH 扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒, 作为定量检测基因表达的标准品, 并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR 扩增产物经测序分析证实为 VDR 及 GAPDH 特异性片段; 该方法检测 VDR 与 GAPDH 灵敏度达 40 拷贝/μL; 线性范围为 4.00×101～4.00×105 拷贝/μL; 决定系数 R2分别为 0.998、 0.999; 扩增效率 E 分别为 96.10%、 85.15%; 批内变异系数（CV）分别为 0.09%~ 1.21%、 0.35%~0.88%; 批间 CV 分别为 0.17%~0.51%、 0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人 VDR 及 GAPDH 的双重实时荧光定量 PCR 方法, 且该方法特异性好、 灵敏度高、 可快速高通量检测 VDR 的相对表达量, 有效缩短时间, 减小实验误差。     

实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因

目的 探索实时定量PCR检测临床、环境细菌中blaCYX-M-14基因流行情况.方法 将收集的65份标本先用ESBL表型确认试验及其KB琼脂扩散法初筛,然后通过菌落平板计数,实时定量PCR方法测出细菌blaCYX-M-14基因C(t)值,最终计算得到平均每个待测细菌中的blaCYX-M-14基因的单个拷贝数.结果 从65份标本中分离得到4株产ESBLs的大肠埃希菌,实时定量PCR检测后得到四株细菌的blaCYX-M-14基因C(t)值依次为11.08,11.63,11.80,13.46,拷贝数分别为6.92×107copies/μl菌液,4.67×107copies/μl菌液,4.22×107copies/μl菌液,1.35×107copies/菌液,即1.05copies/细菌,1.90copies/细菌,2.92copies/细菌,1.10copies/细菌.结论 细菌blaCYX-M-14基因拷贝数的高低与细菌多重耐药现象正相关,建立的实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因的方法具有直观,快捷的优点,有助于检测临床及其环境中耐药菌blaCYX-M-14基因流行情况.     

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列,建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品,评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系;该方法最低检测限为102 copies／μl,特异性良好,重复性良好,变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系,具有良好的临床应用前景。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

目的用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列,并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测,建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果曲线相关系数为99.5%,具有较高的可信度。负相关范围在5×10^3-5×10^9copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好,准确度高,应加大研究降低成本应用于检验应用。     

腺病毒载体HIV疫苗在C57BL/6小鼠体内的生物分布评价

目的:建立腺病毒载体HIV疫苗检测的实时荧光定量PCR方法,并评价疫苗在C57BL/6小鼠体内的生物分布。方法:以gag基因片段为检测对象,建立绝对定量PCR方法。C57BL/6小鼠单次肌内注射5×109vp HIV疫苗,给药后d 3,15,30,60,85收集组织脏器,用建立的荧光定量PCR方法定量检测HIV疫苗。结果:检测方法线性范围为1×102～1×107copies.μL-1,特异性强,重复性较好。HIV疫苗主要分布在注射位点,淋巴结、脾脏和肝脏也有少量分布;疫苗的量随时间延长逐渐减少。结论:肌内注射HIV疫苗后导致广泛的分布,分布的量呈时间依赖性减少,没有生殖细胞转移的危险,HIV疫苗在小鼠体内是安全的。     

实时荧光定量PCR检测ESBLs基因型方法的研究

目的:建立一种快速检测革兰阴性杆菌产超广谱β内酰胺酶(ESBLs )耐药基因分型的SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR方法.方法:针对临床常见ESBLs的耐药基因SHV、TEM、 CTX-M、OXA及其同源性分析,设计了SHV、TEM 、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、OXA-1、OXA-2及OXA-10 共9对特异性引物,煮沸法提取DNA模板,建立并优化SYBR GREEN I实时荧光定量PCR反应体系,并对其精密度、线性范围进行测定.利用建立方法对51株表型阴性的多重耐药的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行ESBLs耐药基因检测,并与改良三维实验进行对比.结果:从39株ESBLs表型阳性菌株及51株ESBLs表型阴性多重耐药菌株中扩增出除OXA-2外共8种耐药基因型并经测序证实.线性检测范围3×10~3~3×10~8拷贝/mL , r ＝ -0.994 7 ;批间重复性试验变异系数(CV)为9.6%.荧光定量PCR方法与改良三维实验方法比较差异无统计学意义( χ2 = 1.125,P > 0.05).结论:SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR检测ESBLs的耐药基因具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的特点,适于临床监测革兰阴性杆菌产ESBLs 基因型.     

SYBR-Green实时定量PCR用于Vero宿主细胞DNA残留量的检测

目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法。方法:提取Vero细胞基因组DNA,设计细胞基因组高度重复顺序AGMr(HindIII)-1基因片段的特异性引物,通过PCR扩增AGMr(HindIII)-1序列中一段特异性cDNA片段,克隆至pGEM-T Vector,重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr(HindIII)-1-S。结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检测标准品,均取得了良好的结果,其检测灵敏度分别达到了0.03 fg.μL-1和0.03 pg.μL-1。结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量。     

实时荧光定量PCR检测MT2-MMP在肺癌中的表达及其临床相关性

目的建立实时荧光定量PCR检测肺癌组织中膜型基质金属蛋白酶2(MT2-MMP)基因表达的方法,并探讨MT2-MMP的临床相关性。方法肺癌组织及癌旁正常组织取自21例非小细胞肺癌手术患者。设计人MT2-MMP、内参照β-actin基因的引物及Taq Man探针,将MT2-MMP及β-actin基因扩增片段纯化后分别构建重组质粒,制备标准品。检测肺癌及癌旁正常组织中MT2-MMP及β-actin的基因表达水平,并分析其临床相关性。结果经测序验证,PCR扩增产物为MT2-MMP及β-actin基因的特异片段。MT2-MMP、β-actin基因表达灵敏度分别为600拷贝/ml、300拷贝/ml,线性范围分别为6×102~6×107拷贝/ml、3×102~3×107拷贝/ml,相关系数均为1.000,扩增效率分别为88.1%、86.2%,批间变异系数分别为0.40%~1.55%、0.59%~3.98%。MT2-MMP在肺癌组织中的基因表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05),但与患者临床病理参数无相关性。结论成功构建了检测人MT2-MMP的实时荧光定量PCR方法,该法特异性好,灵敏度高;MT2-MMP可能参与肺癌的...     

双重实时荧光定量PCR技术检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌

目的: 建立双重实时荧光定量 PCR( multiplex quantitative real-time PCR,multiplex q PCR) 快速检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌 2 种常见控制菌的方法。方法: 筛选两种目标菌株的特异性引物与探针,扩增沙门氏菌的 inv A 基因和大肠埃希菌的 uid A 基因,优化反应体系,建立双重荧光定量 PCR 方法。结果: 两对引物探针对沙门氏菌和大肠埃希菌均有较好地扩增效率,人工污染中药制剂中沙门氏菌的检出限为 10¹CFU·m L^{- 1},大肠埃希菌的检出限为 10¹CFU·m L^{- 1}。结论: 本研究建立的双重实时荧光定量 PCR 方法具有特异性强、重复性好,灵敏度高等特点、适用于中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌的快速检测。     

白细胞介素-6对肝细胞载脂蛋白M表达的影响

目的:研究白细胞介素(IL)-6对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)载脂蛋白(apo)M表达的影响及两者在糖尿病病程中的作用.方法:体外培养HepG2细胞,分别以不同浓度的IL-6干预细胞24 h,提取细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(PCR),琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR检测apoM的表达,并同时检测另一种载脂蛋白apoA-I的表达.用同样的干预方式,检测IL-1α对apoM表达的影响.结果:IL-6(1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/L)对HepG2细胞apoM的表达具有抑制作用,与对照组(0 μg/L)比较差异有统计学意义(F=10.778,P＜0.01),但是IL-6的干预对apoA-I表达水平的影响差异无统计学意义(F=2.004,P＞0.05),IL-1α(1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/L)对apoM表达的影响差异亦无统计学意义(F=2.038,P＞0.05).结论:IL-6能够抑制HepG2细胞apoM的表达,这可能是2型糖尿病患者脂代谢异常以及大血管并发症的发病机制之一.     

慢性乙型肝炎患者血清 AFP和 AFU 水平组合检测必要性研究

目的：探讨慢性乙型肝炎患者血清病毒含量与甲胎蛋白（ AFP）和a-L-岩藻糖苷酶（ AFU）组合检测临床应用的必要性。方法选择116例慢性乙型肝炎患者血清进行病毒含量（ HBV-DNA）、AFU与AFP浓度检测,根据病毒含量分组：HBV-DNA 1×10^3 copies/ml以下为阴性组;HBV-DNA 1×10^4～1×10^5 copies/ml为低病毒量组;HBV-DNA 1×10^6～1×10^8 copies/ml为高病毒量组,对每组组合检测结果进行分析。结果不同病毒含量组AFU、AFP浓度变化与正常对照组比较的差异则有统计学意义（P＜0．05）。 AFU与AFP的阳性比例随病毒复制量的增加而升高。结论慢性乙型肝炎患者,在定期进行病毒含量检测评估病毒的复制状况的同时,进行AFU和AFP水平组合检测发现肝组织的损害程度及演变过程,是必要的。     

实时荧光定量RT-PCR检测内皮细胞t-PA mRNA方法的建立

目的建立实时RT-PCR检测人微血管内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(t-PA)mRNA的表达。方法提取人微血管内皮细胞总RNA,经RT-PCR获得靶基因(t-PA)及管家基因(β-actin)的PCR产物。纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR G reen I定量PCR检测,建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、精密度和重复性。分析全反式维甲酸对内皮细胞表达t-PA mRNA的干预效果。结果定量方法特异性好,检测的灵敏度达103拷贝,线性范围为103~1010拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r2>0.990),批内变异≤3.10%,批间变异≤4.93%。1.25~20.00μmol.L-1的全反式维甲酸能明显上调内皮细胞t-PA mRNA的表达(P<0.01),且呈剂量依赖性。结论实时荧光定量RT-PCR的方法可对t-PA mRNA的表达进行准确定量,有助于溶栓药物药理学研究和新药筛选。     

马来酸海那替尼的大鼠在体肠吸收研究

目的：研究马来酸海那替尼大鼠在体肠吸收的情况。方法：采用大鼠在体肠单向灌流吸收实验模型,并应用重量法校正灌流液体积,HPLC法测定灌流液中药物浓度,进行了有无胆汁分泌、不同浓度、不同肠段的在体肠吸收试验。结果：结扎胆管组与不结扎胆管组吸收速率常数（Ka）分别为3．5×10^-2、4．3×10^-2／min,表观吸收系数（Papp）分别为3．0×10^-3、3．1×10^-3cm／min;在高、中、低3个浓度下的Ka分别为3．9×10^-2、4．3×10^-2、4．3×10^-2／min,Papp分别为2．3×10^-3、3．1×10^-3、3．1×10^-3cm／min;在十二指肠、空肠、回肠、结肠的Ka分别为4．5×10^-2、3．7×10^-2、4．2×10^-2、4．1×10^-2／min,Papp分别为3．3×10^-2、2．8×10^-2、3．0×10^-2、3．5×10^-2cm／min。结论：胆管结扎与否不影响药物的吸收;不同浓度对海那替尼在大鼠全肠道的吸收无显著影响,吸收机制为被动扩散;海那替尼在各肠段均吸收良好,没有特定吸收部位,适于制成口服吸收制剂。     

前癃通胶囊对大鼠前列腺增生组织中转化生长因子β1及其mRNA表达的影响

目的通过免疫组化、原位杂交等实验方法观察前癃通对大鼠前列腺增生组织中TGF-β1及其mRNA阳性表达的影响,从翻译和转录水平探讨该胶囊治疗良性前列腺增生的相关分子机制,以便前癃通胶囊能更好地应用。方法选择60只雄性SD大鼠,完全随机选取10只作为正常对照组,其余50只进行造模。造模成功后完全随机分为模型组、癃闭舒组及前癃通低、中、高剂量组各10只,采用免疫组化及原位杂交观察各组大鼠前列腺增生组织中TGFβ1平均灰度值、积分光密度及阳性细胞总面积的差异。结果前癃通高、中剂量组及癃闭舒组大鼠前列腺组织中TGF-β1平均灰度值分别为（2．00±0．69）×10^4、（2．84±0．54）×10^4和（2．62±0．62）×10^4,与模型组的（3．66±0．89）×10^4比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;前癃通高、中剂量组及癃闭舒组大鼠前列腺组织中TGF-β1积分光密度分别为（1．05±0．29）×10^3、（1．74±0．51）×10^3和（1．76±0．47）×10^3,与模型组的（2．83±1．15）×10^3比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;前癃通高、中剂量组及癃闭舒组大鼠前列腺组织中TGF-β1阳性细胞总面积分别为（4．78±0．95）×10^3、（5．76±0．69）×10^3和（5．63±0．88）×10^3,与模型组的（7．13±0．98）×10^3比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。低剂量组大鼠前列腺组织中TGF-β1积分光密度、阳性细胞总面积分别为（2．14±0．44）×10^3和（6．36±1．06）×10^3,与模型组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。前癃通高剂量组大鼠前列腺组织中TGF-β1平均灰度值、积分光密度、阳性细胞总面积均低于癃闭舒组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论前癃通胶囊可以降低大鼠前列腺组织中TGF-β1的阳性表达,降低大鼠前列腺组织中TGF-β1,mRNA的阳性表达。     

HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性重型乙型肝炎死亡患者的临床特征比较

目的探讨HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性重型乙型肝炎患者的临床特征。方法对95例慢性重型乙型肝炎患者的临床资料、肝功能、肝纤维化指标、HBVDNA载量及并发症发生率进行回顾性分析。结果95例患者中,HBeAg阳性41例（43％）,HBeAg阴性54例（57％）。HBeAg阳性组与HBeAg阴性组平均发病年龄,ALB、TB、CHE、肝纤维化指标及肝衰竭并发症发生率差异无统计学意义（P〉0．05）。HBeAg阴性患者的ALT、AST分别为（400．37±413．59）U／L和（578．14±600．23）U／L,高于阳性患者的（198．25±215．37）u／L和（254．78±269．16）U／L（P〈0．05）。HBeAg阳性患者的HBVDNA载量为（6．17×10^6±8．24×10^1）copies／ml高于阴性患者的（2．39×10^5±6．75×10^1）copies／ml,两组间具有显著差异（P〈0．05）。另外HBeAg阳性患者的左肝前后径及右肝厚度分别为（65．12±12．43）mm及（95．37±12．69）mm,均高于阴性患者的（56．78±11．04）mm和（89．34±9．23）mm（P〈0．05）。结论HBeAg阴性慢性重型乙型肝炎患者与HBeAg阳性患者相比在较低的HBVDNA载量下,仍引起较高的肝损伤和较大幅度的肝脏萎缩。     

山西省早发冠心病患者载脂蛋白M基因多态性的研究

目的探讨载脂蛋白M基因（apoM）-778T/C多态性与早发冠心病（CHD）的关系。方法对经冠状动脉造影证实的早发CHD患者46例（早发CHD组）和同期冠状动脉造影阴性,排除早期CHD诊断的患者60例（对照组）进行研究。采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性（PCR-RFLP）分析技术分析apoM-778T/C基因多态性。同时检测研究对象的血脂水平。结果早发CHD组apoM-778C等位基因频率明显高于对照组（18.9%与7.5%,P=0.002 4）,早发CHD组TT基因型的总胆固醇（TC）水平明显低于TC＋CC基因型[（5.2＋0.7）mmol/L与（6.1±0.7）mmol/L,P=0.001],早发CHD组TT基因型的HDL-C水平明显高于TC＋CC基因型[（1.30±0.50）mmol/L与（1.02±0.20）mmol/L,P〈0.05]。结论 apoM-778T/C基因多态性与早发CHD的发生发展有关,并影响血脂的水平。     

拉米夫定治疗期间15例妊娠妇女母婴HBV传播及婴儿发育的回顾性调查

目的：调查拉米夫定治疗期间妊娠的乙型肝炎病毒感染妇女母婴HBV传播及婴儿发育状况。方法：收集我院2002年1月至2007年6月15例应用拉米夫定治疗期间妊娠的乙型肝炎病毒感染妇女的资料。调查分析母婴的肝功能和HBV DNA水平，妊娠并发症以及婴儿发育状况。结果：15例HBV感染妇女年龄为27—32岁（中位数29岁），其ALT和HBV DNA分别为86—405U／L和6．03×10^5～2．67×10^7拷贝／ml。患者接受拉米夫定100mg，1次／d，用药时间为4—13个月，患者在肝功能恢复正常，HBVDNA〈1×10^5拷贝／ml后开始妊娠，拉米夫定治疗继续至分娩。15例患者的ALT水平在妊娠前和妊娠期均保持正常水平。患者的HBV DNA水平在妊娠前下降至〈1×10^5拷贝／ml（其中80％患者〈500拷贝／ml）。在妊娠期间14例未测及HBV DNA；1例的HBV DNA降至2．45×10^3拷贝／ml，患者ALT水平均降至11—41U／L（中位数23U／L）。未见妊娠并发症。6个月婴儿的ALT为8—33U／L（中位数20U／L），HBV DNA、HBsAg、HBeAg均为阴性，未见发育异常，新生儿Apgar评分为8～10分。结论：拉米夫定似能有效阻断母婴HBV传播，未见婴儿发育异常。