成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达特征的比较研究

目的采用免疫组织化学染色方法研究成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达β1整合素和角蛋白19,14,10(K19,K14,K10)的特征与规律,探讨两种组织表皮干细胞表达特征的差异与烧伤后瘢痕愈合的关系.方法分别取成年人健康皮肤6例和大面积深度烧伤后瘢痕组织6例.采用免疫组织化学Elivision两步法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的修复能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与增殖分化特征的比较性研究

目的采用特殊染色法研究少儿与成年人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮干细胞分布与表达β1整合素和角蛋白19、14、10(K19,K14,K10)的特征与规律,在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系.方法分别取4～12岁少儿及35～53岁成年人2组健康皮肤及大面积深度烧伤后瘢痕组织.采用免疫组织化学SP法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径.方法:采用0.375%的DispaseⅡ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTF法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系.逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性.结论:采用0.375%的Dispase Ⅱ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法.     

人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析

目的:检测人表皮细胞中是否存在侧群(side population,SP)细胞,并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素α6和β1.方法:运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞.经Hoechst33342荧光染料和PI染色,流式细胞仪分析并分选SP细胞.采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素α6和β1的表达情况.结果:人表皮细胞中存在SP细胞,其比例为0.2%～0.3%.用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α6和β1,但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05).结论:表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问,还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实.     

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化特征及其与创面修复结局关系的研究

目的从细胞分化角度研究人胎儿期、少儿期、成年人期皮肤中表皮干细胞增殖分化特征,以及这些特征与创面修复结局的关系.方法分别取因创伤等原因致流产的22～24周龄胎儿和4～12周岁少儿、35～53岁成年人3组全层皮肤.采用免疫组化方法检测表皮干细胞特异表达的β1整合素和细胞角蛋白19(K19).结果胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整合素和K19染色均为强阳性.少儿期表皮基底层细胞中60%～80%的细胞表达β1整合素和K19.成年人表皮基底层中表达β1整合素和K19的细胞较少儿组进一步减少,且染色强度较弱.结论本实验结果提示,胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩充细胞,而少儿期表皮基底层中部分细胞为于细胞和短暂扩充细胞,成年人期干细胞与短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低.这种干细胞增殖分化的差异可能与三种不同发育阶段皮肤损伤的完全与不完全修复有关.     

糖尿病创面表皮干细胞增殖分化相关蛋白的研究

目的：表皮干细胞（epidermal stemcells,ECMs）是皮肤发生、修复、重塑的关键性因素。研究糖尿病创面中ECMs增殖分化相关蛋白-角蛋白19（keratin19,K19）及β1整合素（β1-integrin）的表达,探讨ECMs在糖尿病创面修复中的作用及意义。方法：采用免疫组化SP法检测角蛋白19及β1整合素在各年龄组糖尿病患者创面及正常人全厚皮肤组织中的表达水平。结果：糖尿病患者创面各组角蛋白19及β1整合素的阳性表达分别为81.73±15.31、22.32±5.42,均低于正常人组（P〈0.05）。结论：糖尿病患者创面皮肤组织中ECMs数量少、增殖分化能力差可能是导致糖尿病创面难以修复的重要原因之一。     

瘢痕表皮角蛋白的变化规律及正常表皮细胞培养液对成纤维细胞胶原合成的影响

目的：研究增生性瘢痕和正常皮肤表皮角蛋白的变化规律以及正常表皮细胞培养液对瘢痕和正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法：4例烧伤患者,每人取少量增生性瘢痕和临近的正常皮肤组织,用免疫组化法观察两种组织中与细胞增殖有关的角蛋白14、与细胞分化有关的角蛋白10和与细胞活化有关角蛋白16的变化。收集正常表皮细胞培养12h后的无血清培养液,用DMEM依次配成体积分数为0、5％、10％和20％,分别加入到加有正常和瘢痕组织成纤维细胞的培养板中。分别以MTT法测定吸光度（A）值,Beckman液闪计数仪测定3H-脯氨酸掺人值,分别用以反映成纤维细胞的增殖和胶原合成速率。结果：与正常表皮比较,瘢痕表皮中角蛋白16明显表达增强,角蛋白10降低,角蛋白14无明显变化;正常表皮细胞培养液能促进正常皮肤和瘢痕成纤维细胞的增殖并抑制胶原的合成,但对两种成纤维细胞的作用程度不尽相同,对正常成纤维细胞增殖的促进作用和对胶原合成的抑制作用都较瘢痕成纤维细胞显著。结论：瘢痕表皮的活化可能是瘢痕增生的一个重要因素;正常表皮细胞培养液既能促进成纤维细胞增殖,还能抑制胶原的合成,但对瘢痕成纤维细胞胶原合成的抑制作用较正常成纤维细胞弱。     

皮肤干细胞在胎皮中分布的免疫组织化学研究

目的 采用免疫组织化学方法研究不同时期胚胎皮肤中的干细胞，分析皮肤干细胞的形态、分布特点及发育过程中在胎儿皮肤中的迁徙、增殖分化特征，探讨皮肤干细胞与皮肤发生发育的关系。方法 不同发育时期胎儿皮肤，取材、固定、制成石蜡切片，SP法检测整合素-β1、角蛋白19（K19）、K14、K10和PCNA的表达。结果 胚胎发育期可见整合素-β1阳性的细胞在基底层散在分布。随胎龄增加，整合素-β1表达减弱，表达范围减小。同时，胚胎发育的不同阶段K19均在表皮基底层强烈表达。表皮分层期后，K14阳性细胞从基底层向上延伸至亚基底层。而K10作为表皮终末分化细胞的标志，主要分布在表皮的中层和外层。此外，在毛囊发育过程中，胎皮表皮嵴的细胞相互聚集成团，形成毛囊初级原基，表达整合素-β1、K19、K14及PCNA为阳性。随着毛囊的形成、成熟，皮肤干细胞主要聚集在与表皮相延续的外根鞘、毛囊隆突部及毛母质，表达整合素-β1、K19、K14和PCNA为阳性。结论 （1）皮肤的发生、发育与角蛋白的程序性改变密切相关；（2）毛囊的发生、发育受到毛乳头的诱导作用。毛囊成熟期后，皮肤干细胞主要迁移至与表皮相延续的外根鞘、毛囊隆突部及毛母质等处。此外，还发现毛乳头及其周围组织内分布着单核样细胞表达整合素-β1、K19和K14为阳性。     

成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达特征的研究

目的：观察成人正常皮肤和瘢痕组织中表皮干细胞定位与β1整合素和角蛋白19、14、10（K19、K14、K10）的表达，探讨两种组织表皮干细胞表达特征的差异。方法：取6例大面积深度烧伤患伤后1年的增生性瘢痕组织，另取6例健康志愿对应部位的全层皮肤。采用免疫组织化学Eivision两步法，检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10。结果：瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较正常皮肤明显减少，阳性强度降低，其表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2－3层，而K10表达阳性细胞则较正常皮肤分布广泛；瘢痕组织皮肤的分化过程亦不相同，处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低，而终末分化细胞的比例明显增高。结论：瘢痕组织表皮的修复能力下降。细胞的分化行为紊乱，可能是导致瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一。     

表皮干细胞抽提物重编程脂肪干细胞表达表皮细胞表型的实验研究

目的研究富集的表皮干细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cells,KSC）抽提物对重编程人脂肪干细胞（Adipose derived stem cells,ASCs）表达表皮细胞表型的影响。方法常规方法收集表皮细胞（Keratinocyte,KC）后,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法分别收集KSC与富集后剩余的表皮细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cellsleft,KCL）,鉴定K19和P63的阳性表达率,Gimsa染色法测定KC、KSC、KCL的克隆形成率,分别制备KC、KSC、KCL的细胞抽提物,作用于链球菌溶血素-O（SLO）通透处理过的原代ASCs,分别应用流式细胞仪与Western-blot测定重编程后ASCs中广谱角蛋白（Pan cytokeratin,P-CK）与ASCs的BRG1表达变化。结果 KSC与KC、KCL来源的细胞抽提物重编程ASCs的CK及BRG1表达率,均有明显统计学差异（P〈0.01）。结论脂肪干细胞在表皮细胞抽提物的诱导作用下能表达表皮细胞表型,且对表皮细胞优化处理后的KSC有更加显著的重编程作用。     

SDF-1对创缘表皮干细胞定向趋化及促创面愈合效应的研究

目的：观察干细胞趋化因子SDF-1在创面愈合过程中调控表皮干细胞定向迁移促进创面愈合的过程。方法：制作大鼠背部全层皮肤缺损模型,随机分为三个实验组：①SDF-1组;②AMD3100（CXCR4受体的拮抗剂）组;③空白对照组。分别于致伤后1天、3天、5天、7天和12天照相计算伤后不同时间创面占初始创面的百分比并取材。运用HE染色和免疫组化技术观察创缘表皮干细胞定向迁移分化的特点,寻找其规律。结果：与其他两个处理组相比,SDF-1处理组愈合时间缩短,其创缘皮表皮基底层细胞分裂增殖旺盛,创缘表皮干细胞数目明显多于其他两组。结论：在创面愈合过程中,SDF-1可以调控表皮干细胞向创缘迁移,加速创面上皮化。     

Prevention and treatment of linear scar formation in the scalp: Basic principles of the mechanism of scar formation

Linear scar formation in the scalp after suturing an incision has been considered unavoidable. It was not known why scars formed even if the hair bulb was left intact. The authors developed a subcutaneous tissue-shaving method for radical treatment of bromidrosis and studied the process of hair regeneration by using thick-tissue specimens. They suggest that stem cells (lower) are located not only in the lower end of the telogen hair follicles but also in the sebaceous isthmus at the secretory opening of the sebaceous gland (upper stem cells). They found that linear scars can be prevented and existing linear scars can be surgically treated by using a relaxed suture on a scalp incision to avoid excessive pressure on the upper stem cells.     

快速贴壁法分选表皮干细胞及其评价

目的:认识表皮干细胞对IV型胶原的黏附特性,评价重复利用IV型胶原以快速贴壁法在分选表皮干细胞中的作用。方法:未包被胶原培养瓶的细胞作为对照组I,首次IV型胶原和三次IV型胶原包被的培养瓶分别作为实验组I和实验组II,将包被IV型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组III。人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数,数据用SAS软件分析。对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察,并用β1整合素、K19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:与对照组相比,胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5天铺满培养瓶底,而对照组12天后仍未铺满瓶底。各实验组细胞15min贴壁数无明显差异(P>0.05)。贴壁细胞β1整合素和K19表达阳性。结论:表皮干细胞对IV型胶原具有较好的黏附特性,利用快速贴壁法可以得到较高纯度的表皮干细胞,重复利用IV型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响并可节约费用。     

增生性瘢痕表皮细胞差异蛋白的初步分析

目的检测并鉴定增生性瘢痕角质形成细胞（HK）较正常者差异表达的蛋白质，揭示HK在增生性瘢痕（HS）形成过程中的作用。方法利用消化法分离5例HS（均位于四肢、处在增生期）组织HK，提取其中总蛋白质，利用双向电泳技术展示蛋白质分子的差异表达，并对差异蛋白进行质谱分析。结果初步建立了〉600个点的在体HK双向电泳图谱，筛选差异蛋白质点24个，其中HK较正常高表达点8个，低表达点9个，极低表达4个，新发现的蛋白质点3个；对2个点质谱鉴定结果为Maspin前体与Zinc finger protein 226。结论消化分离法获得在体HK并建立其2-D图谱的方法可行，为HS相关蛋白质组研究奠定了一定基础。初步筛选的24个差异蛋白质点及质谱分析所得结果提示HK蛋白表达存在异常，可能与HS的形成有关。     

表皮移植术在烧伤后色素脱失性瘢痕中的应用

目的：观察表皮移植术在烧伤后色素脱失性瘢痕中的治疗效果。方法：将色素脱失性瘢痕表皮去除,保留瘢痕基底,再用电动取皮刀切取健康自体表皮移植,共治疗26例患者。结果：26例患者移植皮片完全成活,随访2个月～3年,色素缺失改善满意,无继发畸形和功能障碍。结论：表皮移植术是治疗烧伤后色素脱失性瘢痕的较理想方法。     

骨髓间充质干细胞在糖尿病模型创面中向表皮细胞分化的初步研究

目的：探讨糖尿病皮肤创面微环境中的骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的可能性。方法：从大鼠骨髓中分离纯化骨髓间充质干细胞。选取第3—4代细胞,应用5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU）标记技术进行细胞标记;同时采用一次性腹腔内注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型。2周后,在大鼠背部人工造成圆形创面,将已标记的骨髓间充质干细胞以注射方式回植入糖尿病大鼠创面组织周围,分别于注射后2、3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。结果：BrdU阳性细胞出现在表皮、真皮及皮下组织各层,连续切片表皮层中部分阳性细胞同时也表达角蛋白。结论：在糖尿病渍疡愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。     

人胚胎干细胞来源的成纤维细胞支持无动物源污染条件下的人精原干细胞生长

精原干细胞在人出生后可以连续分裂以支持精子形成,将遗传信息传递给下一代。在本文中,我们成功地从睾丸组织中分离并鉴别人精原干细胞的一种新方法,并在人胚胎干细胞来源的成纤维细胞上扩增人精原干细胞。在这种人胚胎干细胞来源的成纤维细胞上可维持大量的人精原干细胞并且在组合生长因子,特别是胶质细胞来源的神经生长因子存在的条件下扩增至少2个月。细胞表面标志分析显示这些精原干细胞具有高水平的碱性磷酸酶的表达并保持了高水平的胚胎特异阶段抗原SSEA-1,OCT4和CD49f的表达。用逆转录PCR反应检测出OCT4,SOX3,STRA8基因的表达。这些数据清晰地表明运用人胚胎干细胞来源的成纤维细胞来支持人精原干细胞的一个新的策略,并排除了异源物种的污染。这个系统提供了新的机会去了解干细胞巢对于控制精原干细胞自我更新的调节机制,并将对于精原干细胞潜在的临床应用提供有用的精原干细胞。     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。