人外周血单个核细胞不同克隆成分向内皮祖细胞分化的实验研究

目的:探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征。方法:密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中。细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次,然后隔日换液1次,7 d后计数早期克隆。每例血样均分为2等份,1份在获得早期克隆后进行下列实验;另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化LDL,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能。结果:早期克隆中心为圆形细胞,周边是放射状排列的纺锤形细胞,再种植不能形成第2代克隆且无体外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d间出现,再种植可形成第2代内皮细胞克隆,并能在胶原凝胶中形成管腔样结构。其构成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P<0.01)而CD146表达明显增加(P<0.01),2种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化LDL方面未存在显著差异。结论:人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征。     

从外周血单个核细胞中获得内皮祖细胞的方法学研究

目的 探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征.方法 密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.分别采用常规方法(A组)和序列黏附法(B组)培养,A组细胞于接种第4天洗去未黏附细胞然后隔日换液1次;B组细胞接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次.两组细胞均在7 d后计数早期克隆,持续培养直到晚期克隆出现.流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能.结果 早期克隆数目的 获得在2组间差异有统计学意义,但序列黏附法获得晚期克隆数目显著增加(P＜0.05),且B组的早期克隆细胞表达CD3显著减少(P＜0.05).晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d出现,其组成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P＜0.001)而CD146表达明显增加(P＜0.01),只有晚期克隆再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并具有体外血管生成功能.两种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白方面差异无统计学意义.结论 人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,无内皮分化功能;晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征,应用序列黏附法可显著提高晚期克隆获得率.     

黄芪甲苷对人外周血内皮祖细胞体外血管生成能力的影响

目的观察黄芪甲苷对体外培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及增殖、迁移、黏附功能、血管生成能力的影响。方法密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)荧光双染鉴定,流式细胞仪检测细胞表面标志。单个核细胞培养4d后进行实验分组,分为对照组和黄芪甲苷干预组。干预组加入不同浓度的黄芪甲苷(分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)培养72h。分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定来观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力;体外血管生成试剂盒来观察EPCs体外血管生成能力。结果与正常对照组比较,黄芪甲苷组EPCs数量增加,EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管形成能力增强,且黄芪甲苷20μg/mL时作用最显著。结论黄芪甲苷可增加体外培养的EPCs数量,改善EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力等生物学功能。     

内皮祖田胞与血管新生

某些缺血性疾病,如冠心病、脑血管病变等在发生发展的过程中有血管的闭塞和退化,因此,当今心血管病学中一个重要的进展就是兴起了促进新生血管生成的治疗.     

脐血、外周血内皮祖细胞分化成内皮细胞的实验研究

目的探讨人的脐血、外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型和功能。方法新鲜脐血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,在M199培养基中体外培养,3d后去除悬浮细胞,继续培养,诱导EPCs增殖和分化。流式细胞仪检测EPCs标志CD34和内皮细胞特异性标志CD31表型,RTPCR检测ecNOS,flk1/KDR基因水平表达,免疫组化验证蛋白水平表达,并进一步通过NO活性的变化检测内皮细胞的功能。结果流式细胞仪检测,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）刚分离时,CD34阳性表达率为（1.1±0.8）%,培养3d后为（16.9±6.2）%。细胞形态观察发现,刚分离的单个核细胞呈圆形,形态小,3d后有明显集落形成,7d后梭形细胞线样排列,随培养时间增加,细胞形态逐渐变大,呈现出典型铺路石样改变。脐血单个核细胞（umbilicalcordbloodmononuclearcells,CBMC）和PBMC培养10d后,CD31阳性表达率分别为（76±17）%和（82±9）%。RTPCR检测有内皮细胞特异性成分ecNOS,flk1/KDR的表达。免疫组化染色,细胞膜和细胞浆中有弥漫性棕色出现,呈阳性反应,证实了蛋白水平的表达。培养10d的贴壁细胞随着VEGF浓度增加,NO生成增加,具有内皮细胞的功能。结论脐血,外周血EPCs体外分离,纯化,诱导培养后的贴壁细胞表型检测,大部分细胞具有内皮系标志物,并具有产生NO功能。     

睾酮通过上调血管内皮生长因子表达促进外周血内皮祖细胞增殖

目的 探讨雄激素对外周血内皮祖细胞(PB-EPC,)增殖能力的影响及其可能机制.方法 将健康志愿者外周血经密度梯度离心法分离的单个核细胞接种至人纤维连接蛋白包被的培养板中,EGM-2MV培养7天后,多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记的荆豆凝集素和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性为PB-EPC.将贴壁细胞分为5组,前4组分别加入0、1、10、100nmol/L睾酮,第5组加入10 nmol/L雄激素受体阻断剂氟他胺干预3h后,再加10 nmol/L睾酮干预.培养48 h后,MTT比色法检测各组PB-EPC的增殖能力.实时定量PCR检测血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达变化,ELISA检测VEGF分泌量的变化.结果 睾酮呈浓度依赖性促进EPC增殖,雄激素受体阻断剂氟他胺完全阻断睾酮对EPC的促进作用.与空白对照组相比,睾酮在mRNA和蛋白水平上调PB-EPC的VEGF表达,氟他胺可阻断此作用.结论 睾酮通过雄激素受体途径上调VEGF的表达,促进PB-EPC增殖.     

大鼠骨髓单个核细胞体外诱导向内皮分化的研究

目的 :为组织工程研究作准备 ,分离大鼠骨髓单个核细胞并诱导培养向内皮分化。方法 :成年SD大鼠 ,应用Ficoll淋巴细胞分离液 (密度1 .0 77g/ml) ,将长骨骨髓经非连续密度梯度离心 ,收集中层的单个核细胞 ,加入诱导培养基并置于纤维连接素包被的培养板上进行诱导分化 ,观察细胞生长状况 ,以透射电镜及Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化以及流式细胞仪方法对培养细胞进行鉴定。结果 :细胞圆形、纺锤形单层融合贴壁生长 ;Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化染色阳性 ;透射电镜显示细胞具有内皮特征性的Weibel Palade小体。结论 :采用Ficoll密度梯度离心可获得较高纯度的骨髓单个核细胞 ,经体外培养并诱导分化 ,具有血管内皮细胞的特征     

老年2型糖尿病患者外周血单个核细胞对培养的血管内皮黏附性的影响

目的观察老年2型糖尿病患者外周血单个核细胞对培养的血管内皮细胞的黏附性的变化。方法采用单核细胞内皮细胞黏附试验检测24例老年2型糖尿病患者、32例健康对照外周血单个核细胞对培养的血管内皮的黏附性。结果(1)老年2型糖尿病患者组外周血单个核细胞内皮细胞黏附率显著高于健康对照组〔(148±027)倍,P<001〕;(2)经多元回归分析,空腹血糖与单核细胞内皮细胞黏附率呈正相关(r=0041,P<001)。结论老年2型糖尿患者外周血单个核细胞对培养的血管内皮细胞的黏附性增强,高血糖等代谢异常与此黏附性增强有关。     

人外周血单个核细胞向心肌样细胞分化的研究

目的通过体外直接培养人外周血单个核细胞(MNCs),并应用5-氮杂胞苷诱导其分化,探讨MNCs经过培养和诱导能否向心肌样细胞分化。方法以Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离出MNCs,于含20%FBS的DMEM培养液中培养,第3天以10μmol/L的5-氮杂胞苷诱导24 h。第14天,对于所培养的贴壁细胞行肌球蛋白、α-肌节肌动蛋白、结蛋白和肌钙蛋白T的免疫细胞化学染色;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞是否表达-αMHC和-βMHC等基因;同时作CD34、AC133和α-肌节肌动蛋白的流式细胞计数分析(FACS)。结果培养第14天开始纺锤形贴壁细胞数量明显增多,并聚集成簇。免疫细胞化学染色法显示肌球蛋白、α-肌节肌动蛋白、结蛋白和肌钙蛋白T均呈阳性。RT-PCR结果显示经5-氮杂胞苷诱导分化后的MNCs存在α和-βMHC基因的表达。FACS显示,CD34阳性或AC133阳性率为(53.04±5.60)%、α-肌节肌动蛋白阳性率为(42.70±11.73)%。结论体外培养并经5-氮杂胞苷诱导后的MNCs既具有心肌样细胞的部分特点,又具有干细胞的部分特征。在适当的条件下,MNCs有向心肌样细胞分化的潜能。     

脐血外周血内皮祖细胞成内皮细胞的体外比较研究

目的:探讨人脐血、外周血内皮祖细胞(EPCs)体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并对两者分化成内皮细胞的能力进行比较。方法:新鲜脐血和健康成年人的外周血,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离脐血CD34 单个核细胞(MNCCD34 )。脐血单个核细胞(CBMC)、外周血单个核细胞(PBMC)和MNCCD34 在M-199培养基体外培养,血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导EPCs增殖和分化。采用细胞形态学观察比较细胞克隆形成率的区别,流式细胞仪检测不同来源的EPCs分化后CD31阳性细胞率。结果:MNCCD34 培养3 d后,细胞克隆形成率为(24.25±6.5)/(3×107)细胞;CBMC贴壁细胞培养3 d后,为(103.00±10.10)/(3×107)细胞;PBMC贴壁细胞培养3 d后,为(74.25±5.44)/(3×107)细胞。CBMC分化形成的贴壁细胞和细胞簇数目多于PBMC(P<0.05),但单个核细胞分化形成的克隆率均明显高于MNCCD34 细胞(均P<0.05)。细胞培养10 d后CD31阳性率为:CBMC为(76.24±16.54)%,PBMC为(82.2±9.0)%,MNCCD34 为(70.03±10.27)%,MNCCD34-仅为(36.5±11.78)%。结论:相似数目的细胞,CD34 细胞单独培养形成的贴壁细胞和细胞簇数目明显少于CBMC和PB-MC(均P<0.05)。培养10 d后CD31阳性细胞率则差异无统计学意义(P>0.05),提示不同来源的EPCs分化率无显著区别,主要来自CD34 细胞群。     

成年鼠骨髓单个核细胞在体外培养中分化为平滑肌祖细胞

目的:探讨大鼠骨髓单个核细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌祖细胞的可行性。方法:分离4～6周龄的大鼠胫骨、股骨,以4℃预冷的DMEM培养基冲出骨髓,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,在血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)作用下,培养8～12d形成贴壁的梭形细胞。采用CD34与α-SMA免疫荧光染色进行鉴定,RT-PCR法测定其α-SMAmRNA表达情况。结果:在PDGF-BB作用下,82%的骨髓单个核细胞α-SMA染色阳性,78%细胞CD34染色阳性,新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达α-SMAmRNA,体外培养后表达α-SMAmRNA。结论:体外培养的骨髓单个核细胞能分化为平滑肌祖细胞,可作为研究平滑肌细胞分化和筛选抑制再狭窄药物的工具。     

大鼠外周血晚期内皮前体细胞体外培养研究

目的体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）,观察细胞克隆形态并进行鉴定。方法密度梯度离心法分离SD大鼠外周血单个核细胞,EGM-2培养基离体培养。免疫荧光染色鉴定细胞CD34、CD31、CD133、FLk-1、vwF细胞表面标志。Real—TimePCR检测细胞CD34、CD133、FLk-1、eNOSmRNA表达。结果细胞培养10天后可见“铺路石样细胞”和少数“紊乱生长细胞”,传代培养后经免疫荧光及Real—TimePCR鉴定“铺路石样细胞”符合晚期EPCs特点,紊乱生长细胞不表达相应标志。结论通过体外分离长时培养可从大鼠外周血获得晚期内皮前体细胞,具有内皮细胞的特征。     

Peripheral blood mononuclear cells acquire myofibroblast characteristics in granulation tissue

BACKGROUND: Bone marrow-derived cell populations possess progenitor cell capacities. Emerging evidence also suggests significant plasticity of differentiated mononuclear cell lineages. We therefore assessed the distribution of transplanted peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in granulation tissue formation, and evaluated their possible transdifferentiation into myofibroblasts. METHODS: Silastic tubes were inserted into the peritoneal cavity of rats, followed by injection of PKH26-labelled PBMCs isolated from donor animals. At 3, 14 and 21 days, the distribution of PKH26(+) cells as well as their colocalization with myofibroblast/smooth muscle cell [alpha-smooth muscle (alpha-SM) actin] or macrophage markers (ED1/ED2) were determined. RESULTS: Round-shaped PKH26(+) cells accumulated around the implants at 3 days, while myofibroblasts were rare. Later, peritoneal granulation tissue constituted an inner, multilayered capsule primarily comprising alpha-SM actin(+) cells that was surrounded by more loosely organized inflammatory connective tissue. PKH26-labelled, spindle-shaped cells were abundantly found in tissue capsules. As a key finding, granulation tissue at 14 and 21 days contained cells with both PKH26 and alpha-SM actin labelling. Accordingly, a subpopulation of cells staining positive for macrophage markers showed a spindle-shaped morphology and alpha-SM actin expression. CONCLUSIONS: Transplanted PBMCs contribute to granulation tissue, and acquire myofibroblast characteristics during de novo tissue formation. Mononuclear cells may transdifferentiate into myofibroblast-like cells within an inflammatory environment.     

Incorporation of endothelial progenitor cells into mosaic pseudoislets

Pancreatic islet transplantation is limited by extensive apoptosis and suboptimal function of the implanted islets in the longer term. Endothelial progenitor cells (EPC) may be ideal for enhancing both the survival and function of transplanted islets. Here, we describe for the first time the in vitro formation of rat mosaic pseudoislets comprised of pancreatic β-cells with interspersed vasculogenic EPC. Bone marrow-derived EPC displayed a similar phenotype to non-adherent EPC, recently described in the human and mouse. Mosaic pseudoislet formation was enhanced by the use of an embryoid body forming medium (BPEL) and a spin protocol. Mosaic pseudoislets maintained function in vitro and may represent an enhanced cell therapy delivery approach to enhance the survival and revascularisation of transplanted islets.     

Incorporation of endothelial progenitor cells into mosaic pseudoislets

Pancreatic islet transplantation is limited by extensive apoptosis and suboptimal function of the implanted islets in the longer term. Endothelial progenitor cells (EPC) may be ideal for enhancing both the survival and function of transplanted islets. Here, we describe for the first time the in vitro formation of rat mosaic pseudoislets comprised of pancreatic β-cells with interspersed vasculogenic EPC. Bone marrow-derived EPC displayed a similar phenotype to non-adherent EPC, recently described in the human and mouse. Mosaic pseudoislet formation was enhanced by the use of an embryoid body forming medium (BPEL) and a spin protocol. Mosaic pseudoislets maintained function in vitro and may represent an enhanced cell therapy delivery approach to enhance the survival and revascularisation of transplanted islets.     

人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养

目的建立一种稳定的体外分离和培养人脐血来源内皮祖细胞的方法。方法采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,将其接种至人纤维连接蛋白包被的六孔板中,用EGM-2培养基诱导培养。通过形态学观察、细胞表面特异性抗原、摄取功能和体外血管形成能力对内皮祖细胞进行鉴定。结果细胞形态学观察发现,刚分离的单个核细胞较小,呈圆形,4 d后可见少量的圆形和梭形贴壁细胞,8 d后有明显集落形成,14 d后相邻集落相互融合,呈现出典型铺路石样改变。内皮祖细胞能摄取乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,表达CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体2,并且具有体外血管生成能力。结论采用密度梯度离心法可从人脐带血中成功分离和培养出内皮祖细胞,以用于相关实验研究。