BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

精原干细胞移植研究近展

在非灵长类哺乳动物睾丸中，As(Asingle)型精原细胞是精子发生的干细胞。在As型精原细胞分裂的基础上，其子代细胞彼此分开变为两个新的T细胞，或者仍停留在一起，成为通过细胞间桥连接的Aal(Aaligned)型精原细胞。Apr精原细胞是精子发牛普系中的第一代细胞，它将进入分化旁路，进一步发展     

精原干细胞体外培养分化的研究现状

精原干细胞位于雄性哺乳动物曲细精管生精上皮基膜内,是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它同时能向下一代传递遗传信息。然而生精上皮的复杂性使得从分子水平研究精原干细胞的行为非常困难,生精小管内存在多种类别的细胞加大了纯化精原干     

温度对小鼠精原干细胞消化作用的影响

目的 探讨在小鼠精原干细胞体外分离过程中,不同的温度对精原于细胞消化作用的影响.方法 在小鼠精原干细胞体外分离过程中,建立不同的消化温度环境,观察消化酶对小鼠精原干细胞的离散消化效果及精原干细胞的活力和损伤情况.结果 精原干细胞体外消化过程中,37℃环境下消化酶对精原干细胞的消化作用最快,但对精原干细胞的损伤较重;32～34℃环境下消化酶对精原干细胞的消化作用较弱,但对精原干细胞的损伤作用较小,不同温度之间消化快慢与细胞损伤的差异有统计学意义(P＜0.01).结论 在小鼠精原干细胞体外分离过程中,不旧的温度对精原干细胞的活力和所获得的具有增殖能力的精原干细胞数量均有重要的影响,32～34℃环境温度为精原干细胞体外分离较适合的温度.     

小鼠精原干细胞体外培养体系的建立

目的:建立小鼠精原干细胞体外扩增的培养体系。方法:取出生后2~6d的雄性ICR小鼠30只,脱颈法处死,切取睾丸后,采用两步酶消化法制成单细胞悬液,添加特定培养液,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。培养后通过BrdU整合实验检测其增殖能力,并用碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:小鼠精原干细胞在体外稳定增殖,所得克隆AP强阳性,标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-,基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-,证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。结论:在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态,为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。     

精原干细胞和睾丸组织移植的现状及应用前景

随着男性不育症患者的增加，尤其是影响生育力的肿瘤治愈率的提高，使提前采取措施保护这部分患者的生育能力更为迫切。临床上通常使用的冷冻精液只适于成年而不适于青春期前男性。精原干细胞移植和睾丸组织移植为解决上述难题拓展了新的思路和方法，因而成为近年来的研究热点。本文重点介绍精原干细胞和睾丸组织移植的现状及应用前景。     

冻存后大鼠睾丸组织精原干细胞的体外分离培养

目的 研究冻存的大鼠睾丸组织复苏后精原干细胞（SSCs）体外分离培养的生物学特性。方法 用二甲基亚砜（DMSO）作低温保护液，于液氮中冻存。4个月后复苏冻存的睾丸组织，进行SSCs的分离纯化，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层进行培养，并利用碱性磷酸酶（AKP）鉴定SSCs。结果 从冻存睾丸组织分离的精原干细胞在MEF饲养层上的正常形态、增殖能力与新分离的精原干细胞无明显不同。结论 大鼠睾丸组织的冷冻复苏并不影响精原干细胞其原有的生物学特性，包括其正常的贴壁、形态和增殖能力。     

精原干细胞和睾丸组织移植的现状及应用前景

随着男性不育症患者的增加 ,尤其是影响生育力的肿瘤治愈率的提高 ,使提前采取措施保护这部分患者的生育能力更为迫切。临床上通常使用的冷冻精液只适于成年而不适于青春期前男性。精原干细胞移植和睾丸组织移植为解决上述难题拓展了新的思路和方法 ,因而成为近年来的研究热点。本文重点介绍精原干细胞和睾丸组织移植的现状及应用前景     

高温热应激构建小鼠精原干细胞移植受体模型

目的:探讨高温热应激方法构建小鼠精原干细胞(SSCs)移植受体的可行性。方法:将4周龄的C57BL/6雄鼠和B6(Cg)-Tyrc-2J/J毛色基因纯合突变雄鼠置于恒温箱内,43℃热应激处理1 h,通过HE染色、免疫组化染色和TUNEL凋亡检测,寻找最佳移植时间;随后将SSCs移植入小鼠生精小管,定期观察移植后受体小鼠睾丸内SSCs增殖、分化及形成精子的情况,并将受体小鼠与正常同周龄雌鼠交配,观察其后代表观遗传学特征。结果:高温热应激3～5 d后受体小鼠睾丸生精小管内生精细胞层数减少,排列紊乱、疏松且大量缺失,间质细胞数量明显减少,生精细胞凋亡明显,自噬水平升高,12 d左右基本恢复。在分离纯化后的SSCs移植8周后,受体小鼠睾丸生精小管内分化形成生精细胞及具有遗传功能的精子,经过自然交配产生正常的后代。结论:高温热应激方法可快速、高效构建小鼠精原干细胞移植受体模型。     

经睾丸网移植小鼠精原干细胞的研究

目的研究经睾丸网移植小鼠同种精原干细胞的可行性。方法经~(60)Co-γ射线全身照射后,在基因型相似的Balb/c小鼠间经睾丸网进行精原干细胞移植,移植后3个月,观察其生精恢复情况。结果形态学证实,成功移植的小鼠精原干细胞生精过程部分恢复。结论在基因型相似的Balb/c小鼠间经睾丸网进行精原干细胞移植是可行的。     

小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法

目的：探索BALB／c小鼠肝星状细胞（HSCs）分离、纯化的可行方案．并评价依该法分离所得HSCs的生物学特性。方法：经肝门静脉先用不含钙镁离子的Hank液充分灌洗,再以浓度为1mg／mL的Ⅳ型胶原酶灌注BALB／c小鼠肝脏。取肝后．完整分离后碾碎,37℃水浴振荡30min,Percoll连续密度梯度（60％）离心法分离、纯化HSCs．苔盼蓝染色检测HSCs活性,结蛋白免疫细胞化学鉴定HSCs,光镜观察体外培养HSCs的形态学变化。结果：纯化后每只小鼠HSCs收获量约为（5．5±0．4）×10^5个．HSCs纯度〉90％．HSCs细胞活率〉90％。结论：本实验建立的的分离纯化方案可获得高纯度高活率的小鼠HSCs。     

胶质细胞源性神经营养因子对体外培养小鼠精原干细胞增殖分化作用的影响

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对体外培养小鼠精原干细胞(SSC)增殖与分化的影响.方法 雄性昆明小鼠80只.采用Percoll密度梯度分离及差速贴壁法纯化SSC,免疫荧光染色及流式细胞检测方法鉴定.将获取的SSC随机分为实验组和对照组,以支持细胞作为饲养层培养SSC,实验组每5 ml DMEM/F12完全培养液中添加0.02 μg GDNF.酶联仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞生长周期;采用卵泡浆内显微注射(ICSI)技术将精子细胞与卵母细胞结合,观察卵裂细胞数,体外培养3 d后行染色体数量分析.结果 添加GDNF培养的SSC第6、9、12、15天吸光度(A)值分别为0.448±0.028、0.502±0.062、0.556±0.045、0.621±0.072,与对照组0.377±0.053、0.402±0.071、0.432±0.019、0.461±0.037比较差异有统计学意义(P＜0.05);第3、6、9、12、15天SSC DNA合成期(S期)含量分别为20.86、26.34、31.23、37.54、28.02,与对照组1.69、1.73、2.56,4.85,1.82比较差异均有统计学意义(P＜0.05);精子细胞与卵母细胞结合后可得到含有20对染色体的配子.结论 ICSI技术可为鉴定SSC体外分化为精子细胞提供较充分的依据;GDNF能促进SSC的体外增殖与分化.     

不同胚龄人神经干细胞的分离和培养

目的 探索不同胚龄人神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下，采用无血清培养和单细胞克隆技术，从7周和13周人胚脑中分离和培养神经干细胞，应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，未包被组7周的人胚脑除高密度县浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成；13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成；包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。     

人脐血造血干/祖细胞的磁力搅拌悬浮培养及移植实验

目的 探讨磁搅拌大规模培养体系对人脐血造血祖细胞的扩增效果以及扩增的人造血祖细胞植入动物体内后的造血重建情况.方法 从新鲜抗凝脐血中分离出单个核细胞(MNC),以添加干细胞因子、酪氨酸激酶受体3配基及血小板生成素的无血清培养体系进行培养.静态扩增组的细胞置于T25培养瓶中培养,磁搅拌悬浮扩增组(磁搅拌扩增组)的细胞采用Celstir装置进行培养,培养体系为50～100 ml.培养7 d后进行细胞计数、集落培养检测和细胞表面分子表达的测定.以不进行培养者为对照组.非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠在接受2.5 Gy的亚致死剂量X射线照射后分别从尾静脉输入上述静态扩增组、磁搅拌扩增组和对照组的MNC(5×106个),另设不移植的空白对照组.观察小鼠的存活情况,6周后处死存活小鼠,检测骨髓细胞中CD34+细胞、CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 经过7天的培养,磁搅拌扩增组的造血祖细胞扩增倍数为(2.8±0.45)倍,明显高于静态扩增组的(2.1±0.48)倍(P<0.01).磁搅拌扩增组形成的红系集落、粒-巨噬细胞集落数均明显高于静态扩增组(P<0.05).静态扩增组扩增后的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CD133+细胞含量均高于磁搅拌扩增组(P<0.05),而CD184+细胞和CD62L+细胞含量低于磁搅拌扩增组(P<0.01).移植后6周,对照组、静态扩增组和磁搅拌扩增组分别有3、4、5只小鼠存活,三组间两两比较,6周存活率的差异无统计学意义(P>0.05).存活6周的小鼠,其骨髓中能检人特异性CD34+细胞,以及CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞,也检测到人Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达.结论 磁搅拌培养能大规模扩增脐带血造血祖细胞,扩增的细胞能植入x射线照射的NOD/SCID小鼠,并重建其多系造血.     

动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.     

小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

人诱导性多能干细胞的无饲养层培养及鉴定

目的：探索人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的无饲养层培养方法,并对此方法培养的iPSCs进行鉴定。方法将人iPSCs接种于玻璃粘连蛋白（Vitronectin XF）包被的培养皿上培养,采用EDTA消化传代。倒置显微镜下观察iPSCs的生长状态;碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定;采用PCR和免疫荧光检测iPSCs多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2的表达情况。结果倒置显微镜下可见iPSCs呈典型的克隆状生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰、整齐;ALP染色结果阳性;PCR结果显示人iPSCs强表达多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2;免疫荧光结果显示多能干细胞特异性指标SSEA?1、Nanog、Sox2均呈阳性。结论无饲养层培养体系培养人iPSCs,细胞能稳定增殖,保持自我更新潜能及多能性。     

小鼠同种生精干细胞移植后的形态学观察

目的 研究同种生精干细胞移植的后的形态学变化。方法 在不采用免疫抑制剂的条件下,在基因型相似的封闭群昆明白小鼠间进行同种生精干细胞移植,移植后3个月,观察其生精恢复情况。结果 形态学证实,成功移植的小鼠生精功能基本恢复正常。结论 在基因型类似的昆明白小鼠进行同种生精干细胞移植是可行的。     

酶预消化连续组织块法培养大鼠脂肪来源干细胞的研究

目的 采用胰蛋白酶+I型胶原酶预消化后连续组织块法进行SD大鼠脂肪来源干细胞的体外培养,并和Zuk的胶原酶消化法培养效果相比较,为脂肪来源干细胞的体外培养方法提供参考依据.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,分A、B两组.A组使用D-Hank's液冲洗净后剪成8mm3左右组织块.0.25%胰蛋白酶消化5min后,0.1%I型胶原酶消化组织块20min,将组织块置于孔径1mm的尼龙网放至培养皿贴壁培养,3-4d后将组织块连同滤网放至下一培养皿中以连续组织块法培养3-4次.B组使用Zuk的胶原酶消化法培养.采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志.结果 A、B两组培养的细胞均具有典型的干细胞形态特征,生长曲线相似,脂肪干细胞标志CD105、CD44呈阳性表达.结论 采用酶预消化连续组织块法可以进行脂肪来源干细胞的培养,并且能在短时间内获得多个脂肪干细胞样本,具有一定的应用价值.