成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因条件性敲除模型建立

目的:建立成年神经发生中新生颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚型基因条件性敲除模型。方法:运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-1oxp重组酶系统,在ROSA26-LacZ基因报告小鼠体内研究逆转录病毒RSV-pGFP:T2aCre的Cre酶重组的发生以及其转化效率。在NR2Bfl/fl转基因小鼠中建立成年新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型。结果:在逆转录病毒注射后14 d,观察到LacZ标记的神经元及β-gal和Cre免疫荧光双标阳性细胞,在海马齿状回颗粒下层、颗粒层以及hilus区表达;同时在嗅球颗粒层也可见LacZ表达。28 dCre转化效率高达98.3%。在NR2Bfl/fl转基因小鼠,14 d时分别在嗅球和齿状回的颗粒细胞层,观察到GFP和Cre同时标记的阳性新生颗粒细胞。结论:成年神经发生中起源于海马齿状回颗粒下层和侧脑室旁脑室管膜下区的新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型建立。     

高功率微波辐射后大鼠海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体表达的变化及其意义

目的观察高功率微波（HPM）辐射后大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体表达的变化及其意义。方法采用10mW／cm^2和100mW／cm^2 HPM辐射110只Wistar雄性大鼠，于辐射后6h、1d、7d、14d和28d活杀取海马组织，采用免疫组化、原位杂交和图像分析等技术分析海马组织中NMDA受体——NR1、NR2A和NR2B的蛋白及mRNA含量的变化。结果10mW／cm^2及100mW／cm^2 HPM辐射后，可见大鼠海马神经元固缩等病理变化，100mW／cm^2组的病变较10mW／cm^2组严重，且恢复迟。2个辐射组的NR1、NR2A及NR2B的表达均增强；10mW／cm^2组辐射后6h，NMDA受体表达始见增加，1d达高峰，28d基本恢复；100mW／cm^2组照后6h，NMDA受体表达始见增加，7d达高峰，28d基本恢复，且与10mW／cm^2组相比，100mW／cm^2组增高明显，恢复较迟。NR1mRNA变化规律与其蛋白表达类似。结论10mW／cm^2及100mW／cm^2 HPM辐射可造成大鼠海马神经元损伤，使NMDA受体表达上调，参与HPM致海马组织损伤的病理生理过程。     

腺苷A1受体敲除小鼠戊四氮点燃后脑组织病理形态学变化

目的:通过观察腺苷A1受体敲除小鼠戊四氮点燃后脑组织病理形态学变化,探讨腺苷A1受体的神经保护作用。方法:腺苷A1受体基因敲除纯合型(-/-)小鼠20只纳入敲除鼠组,腺苷A1受体基因敲除野生型小鼠20只纳入野生型组,C57BL/6小鼠10只纳入对照组。敲除鼠组和野生型组小鼠制作戊四氮点燃癫痫模型,于点燃成功后24 h、30 d采用尼氏染色观察各组小鼠海马及皮质神经元的形态结构变化。结果:野生型组小鼠点燃后皮质和海马神经元损伤较敲除鼠组出现晚、范围小,损伤程度轻。结论:腺苷A1受体对癫痫发作小鼠具有神经保护作用。     

行为训练对大鼠海马梗死灶周围及颞叶皮层NR2B表达的影响

目的研究行为训练对双侧海马梗死大鼠梗死灶周围及颞叶皮层N-甲基-D天门冬氨酸（NMDA）受体2B亚单位（NR2B）表达的影响。方法将54只大鼠随机分为行为训练前、训练7d、14d、21d组；制动前、制动7d、14d、21d组及正常对照组。于造模3d后开始分别给予行为训练或制动，观察不同时间点各组大鼠海马梗死灶周围及颞叶皮层NR2B的表达。结果正常大鼠海马及颞叶皮层内均有NR2B的丰富表达，造模后明显下降，给予行为训练后逐渐增高，较制动组有非常显著性差异（P〈0．01）。结论行为训练能促进海马梗死大鼠梗死灶周围及颞叶皮层内NR2B的表达。     

睫状神经营养因子对NMDA引起海马神经元损伤的作用

目的：以Glu离子型受体激动剂L-NMDA诱发海马神经元损伤为细胞损伤模型，用JAK/STATs阻断剂PTPi-2阻断睫状神经营养因子（CNTF）已知的经典信号转导途径，观察CNTF非经典信号转导途径的神经保护功能，并探讨其可能机制。方法：用无血清培养液（B27）法行新生24b内大鼠海马神经元原代培养，以培龄13d的细胞为实验标本，分对照组、L—NMDA组、CNTF＋L—NMDA组、PTPi-2＋CNTF＋L—NMDA组，观察活细胞连续照相的形态变化和细胞存活率。结果：L-NMDA可引起海马神经元毒性反应，这一损伤反应在作用时间处于1-2hr之间时呈时间依赖性．在L—NMDA作用浓度介于0-500μmol／L之间时呈剂量依赖性；CNTF可有效抑制L—NMDA对神经元的毒性作用：使用PTPi-2阻断已知的CNTF经典信号转导途径中JAK／STATs后，CNTF保护海马神经元抵抗L—NMDA的损伤作用仍然存在。结论：提示CNTF对海马神经元的保护作用可能通过未知的非基因组途径来完成。     

NMDA受体参与电刺激坐骨神经诱导的大鼠海马CA1区长时程增强

目的:观察NMDA受体拮抗剂MK801中枢应用对外周电刺激坐骨神经诱导海马CA1区LTP及NR2B表达的影响,探讨电刺激坐骨神经诱导的海马长时程增强的机制。方法:45只雄性SD大鼠随机分为单刺激组、强直刺激组、MK801组,单刺激坐骨神经在海马CA1区诱发场电位,30 min后,单刺激组和强直刺激组侧脑室各注射人工脑脊液(5μl),MK801组侧脑室注射MK801(500 ng/5μl),强直刺激组和MK801组给予强直刺激,然后持续给予单刺激2小时,单刺激组一直给予单刺激,观察各组场电位的幅度、潜伏期变化。记录结束后,Western blot的方法检测海马CA1区NR2B的表达。结果:电刺激坐骨神经诱发的海马CA1区LTP被NMDA受体非竞争性受体拮抗剂MK801所抑制。同单刺激组相比,强直刺激组海马NR2B表达升高,而MK801组同单刺激组相比无明显差异。结论:电刺激坐骨神经C类纤维诱导的海马CA1区LTP由NR2B介导。     

吡咯喹啉醌对NMDA诱发大鼠海马神经元损伤的影响

目的探讨吡咯喹啉醌（PQQ）对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱发海马神经元损伤的影响。方法体外原代培养新生大鼠海马神经元，毒性剂量的NMDA诱致海马神经元损伤，预加PQQ，镜下观察神经元的形态变化，琼脂糖凝胶电泳观察细胞的死亡情况，激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca^2＋浓度的变化。结果体外培养8d的海马神经用0．1mmol／LNMDA处理后，细胞内Ca^2＋快速增加，细胞以坏死和凋亡两种形式死亡，细胞的存活率降低；预先给予PQQ可明显减少细胞内Ca^2＋的增加，减少细胞死亡。结论PQQ对NMDA诱发的海马神经元损伤具有保护作用。     

大鼠孕期尼古丁暴露致成年雌性子代抑郁症 易感机制研究

目的:探讨大鼠孕期尼古丁暴露(PNE)致成年雌性子代抑郁症易感的宫内发生机制。方法:将受孕Wistar大鼠随机分为对照组和PNE组,PNE组大鼠于孕9~20 d皮下注射尼古丁2 mg/(kg·d),2次/日。部分子代大鼠于孕20 d取脑切片Neu N免疫荧光染色观察前额叶皮质和海马形态改变;部分大鼠正常出生喂养至3月龄,给予慢性不可预见性温和刺激(CUMS),检测刺激前后雌性子代大鼠行为学改变,实时定量PCR检测前额叶皮质和海马组织中与突触生长发育相关基因的表达。结果:与对照组相比,旷场试验中PNE组成年雌性子代大鼠CUMS后表现为总路程、总速率和直立次数明显减少(P0.05),粪便粒数增加(P0.05),强迫游泳实验中不动时间明显延长(P0.01),表现出抑郁行为;PNE组孕20 d胎鼠前额叶皮质变薄,海马细胞层结构不清,轴突不连续;CUMS后PNE组成年子代前额叶皮质和海马,突触生长发育相关基因NR1、NR2A、NR2B、Syn I和Snap25 m RNA转录水平明显下降(P0.01)。结论:PNE导致大鼠成年雌性子代应激后抑郁症易感性增加,可能与子代前额皮质和海马神经元和突触形成发育等基因转录水平降低,所致前额叶皮质和海马结构和功能改变有关。     

低频电针对海洛因依赖小鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1、NR2A、NR2B亚型蛋白表达的影响

摘要 目的：通过观察低频电针对海洛因心理依赖小鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)的亚型NMDAR1(NR1)、NMDAR-2A(NR2A)、NMDAR-2B(NR2B)表达的影响,探讨低频电针对海洛因成瘾记忆干预作用的可能中枢机制。 方法：筛选无天然位置偏爱的雄性小鼠45只,随机分为对照组、海洛因心理依赖模型组（模型组）、模型电针组（模针组）,每组15只。海洛因剂量递增注射结合条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）训练制作海洛因心理依赖模型,2Hz低频电针“内关”、“三阴交”,点刺“四神聪”穴。采用白箱CPP值变化评价低频电针治疗效应,免疫组化方法检测海马NMDA受体亚型（NR1、NR2A、NR2B）的表达。 结果：①模针组白箱CPP值较模型组明显降低(P＜0.05)。②模针组小鼠NR1、NR2B阳性表达较模型组增强(P＜0.05)。③模针组小鼠NR2A阳性表达较模型组降低(P＜0.05)。 结论：低频电针疗法能增强海洛因心理依赖小鼠海马NR1、NR2B,降低NR2A的阳性表达。这种改变可能与低频电针调节海洛因依赖的机制有关。     

加兰他敏对急性酒精中毒大鼠海马神经元NMDAR2B的影响

目的：探讨加兰他敏对急性酒精中毒大鼠海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）·R2B的影响。方法：将60只大鼠分为对照组、酒精组及加兰他敏组,每组各20只。酒精组以50%（v/v）酒精12 mL/kg灌胃两次/日,共7d。加兰他敏组酒精（浓度、剂量同上）灌胃的同时腹腔注射加兰他敏2mg/kg一次/日,共7d。对照组以等量生理盐水灌胃。实验第8天取大鼠海马区做苏木精-伊红（HE）染色,观察海马区的病理学变化;免疫组织化学采用SABC法,观察海马区神经元NR2B的表达。结果：病理学观察结果：对照组海马区神经细胞排列整齐,胞质淡染,无变性、坏死;酒精组神经细胞层次不清、排列松散、细胞数量减少,部分细胞变性;加兰他敏组神经细胞层次较清、排列较密,细胞数目较酒精组增;免疫组织化学结果：酒精组与对照组比较NR2B阳性表达细胞数量明显减少（P〈0.01）;加兰他敏组与酒精组比较NR2B阳性表达细胞数量明显增高（P〈0.05）;加兰他敏组与对照组比较NR2B表达细胞数量无明显差异（P〉0.05）。结论：急性酒精中毒与海马区神经细胞的NR2B表达下调有关;加兰他敏具有保护急性酒精中毒导致的大鼠海马区神经细胞毒性的作用,其机制可能与加兰他敏上调NR2B的表达有关。     

Th17细胞和白介素-17在异基因造血干细胞移植aGVHD中的免疫调控分析

目的探讨Th17细胞和白介素-17(IL-17)在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)aGVHD中的免疫调控。方法采用野生型(WT)C57BL/6(H-2b)小鼠与C57BL/6(H-2b)IL-17基因敲除(IL-17-/-)小鼠作为供体,采用BALB/C(H-2b)小鼠作为受体,小鼠给予全身照射8.5 Gy进行清髓性预处理,移植野生型(WT)小鼠1×107个去除T细胞骨髓细胞(TCD-BMCs)以及WT小鼠1×106个CD4+IL-17-/-T细胞。移植之后每天对小鼠生存状况进行观察1~2次,每隔5 d对aGVHD进行临床评估。收集实验小鼠肝脏、肺、肠以及皮肤,并进行HE染色并进行病理组织学分析,并对移植后Th17细胞组、CD4+IL-17-/-T细胞组、IL-17-/-BMCs+IL-17-/-SCs组(KK组)、WT BMCs+IL-17-/-SCs组(WK组)及WT BMSCs+WTSCs组(WW组)小鼠的aGVHD积分进行评估。结果 1Th17细胞组移植后5 d、10 d、15 d、20 d aGVHD积分均显著高于IL-17-/-CDD4+T细胞组(P0.05),且Th17细胞组小鼠平均生存时间显著小于IL-17-/-CDD4+T细胞组(P0.05);2KK组、WK组及WW组移植后5 d、10 d、15 d、20 d aGVHD积分差异均具有统计学意义(P0.05),且三组平均生存时间方面的差异也均具有统计学意义(P0.05)。结论 Th17细胞与IL-17在异基因造血干细胞移植aGVHD中具有较好的免疫调控作用。     

Tg-SwDI小鼠的筑巢行为研究

目的:研究不同年龄组Tg-SwDI小鼠与同龄野生型(WT)小鼠筑巢行为的差异。方法:将小鼠按基因(Tg-SwDI和WT)和年龄(2~4月龄、10~12月龄、18~20月龄)分为6组,利用固有筑巢材料在群养小鼠家笼中进行集体筑巢行为实验,之后利用纸巾进行个体筑巢实验。结果:基因(F1,31=37.03,P<0.0001)和年龄因素(F2,31=3.88,P<0.05)对群体筑巢评分均有影响。Tg-SwDI小鼠与WT小鼠相比,各年龄组均有群体筑巢功能的下降。在个体筑巢实验中,2~4月龄和10~12月龄Tg-SwDI小鼠的个体筑巢功能下降不明显,18~20月龄组有显著变化。方差分析提示显著的基因(F1,135=23.64,P<0.0001)和年龄(F2,135=15.46,P<0.0001)影响。结论:Tg-SwDI小鼠可较早出现集体筑巢行为受损,可能反映其早期社交行为改变,与执行功能相关的个体筑巢行为较晚才出现明显下降。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

混合骨髓移植后过继免疫治疗小鼠白血病

背景：急性白血病自体造血干细胞移植后复发率高,异基因造血干细胞移植后移植相关病死率高,混合造血干细胞移植及移植后过继免疫治疗有可能取长补短,提高疗效。目的：观察自体骨髓混合H-2半相合异体骨髓移植后供体淋巴细胞输注＋白细胞介素2治疗对小鼠白血病的疗效。方法：将Balb/c小鼠经直线加速器照射3Gy后分为白血病模型组、白血病模型照射组、混合移植组、自体骨髓移植组,均尾静脉注射5×10^5K562（GFP＋/NeoR＋）或K562（GFP-/NeoR-）细胞。7d后6Gy照射,自体骨髓移植组移植自体骨髓细胞或联合白细胞介素2治疗;混合移植组移植小鼠自体骨髓细胞混合1/10的H-2半相合异体骨髓细胞后应用白细胞介素2或联合供体淋巴细胞输注治疗。4周后行小鼠外周血及骨髓细胞形态检查,外周血细胞亚群、GFP及NeoR基因测定,肝、脾匀浆细胞GFP和NeoR基因测定。结果与结论：白血病模型组小鼠因骨髓造血功能衰竭于20d内全部死亡,白血病模型照射组小鼠因造血功能衰竭于14d内全部死亡;自体骨髓移植组、混合移植组均有多少不等小鼠无白血病存活超过28d,且混合骨髓移植后及自体骨髓移植后应用白细胞介素2治疗可提高白血病小鼠长期无病生存率,在此基础上联合供体淋巴细胞输注可更进一步提高白血病小鼠长期无病生存率。     

造血系统常用Cre转基因小鼠及其应用

Cre-lox重组系统包括Cre重组酶和lox位点两个要素.Cre酶能够特异地识别并催化lox位点间的片段进行重组,lox位点的方向和位置则决定Cre酶的功能效应.小鼠造血系统由多系各个发育阶段的造血细胞组成.它们是由骨髓内的造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）分化发育而来,而造血细胞的增殖发育是在骨髓微环境中进行的.目前有利用Cre-lox重组系统建立的多种转基因小鼠运用于造血系统的研究中,本文将讨论常用于造血系统的Cre转基因小鼠以及它们在造血系统研究中的应用.     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景：研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的：以人主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros,AGM）区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论：拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞占（13.12±1.30）%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。     

BrdU标记法检测不同年龄阶段小鼠神经前体细胞的增殖潜能

背景：BrdU是胸腺嘧啶核苷类似物,常用来标记前脑室管膜下区具有增殖潜能的神经前体细胞。目的：建立不同年龄阶段BrdU标记方法,系统分析不同年龄阶段神经前体细胞增殖特点以及变化规律。方法：选取胚胎期小鼠、新生小鼠、成年小鼠和老年小鼠各5只,腹腔注射BrdU,观察不同年龄阶段神经前体细胞增殖潜能及不同年龄阶段前脑衰老细胞,探讨微环境对神经前体细胞增殖潜能的影响。结果与结论：胚胎期小鼠、新生小鼠、成年小鼠和老年小鼠前脑室管膜下区BrdU＋细胞分别为（897.20±22.38）,（262.17±26.26）,（76.67±5.63）,（43.8±2.61）个,随年龄增加细胞增殖潜能逐渐降低（P〈0.05）。成年小鼠和老年小鼠脑室周围有大量β-半乳糖苷酶染色阳性衰老细胞,说明随年龄增加脑内β-半乳糖苷酶染色活性增强,衰老细胞逐渐增多,神经前体细胞生存微环境失衡可能与神经前体细胞增殖潜能下降有关。     

Sca-1^＋造血干/祖细胞重建致死剂量辐射小鼠造血功能的作用

背景：近年来,造血干细胞移植在国内外已广泛开展,移植的造血干细胞能否有效重建造血成为造血干细胞移植领域的研究热点问题之一。目的：观察Sca-1＋造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell,Sca-1＋HSC/HPC）对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用。方法：雌性C57BL/6受体鼠给予致死剂量60Coγ射线照射后分2组,对照组：输注无菌PBS;移植组：移植免疫磁性分选法分离纯化的同系雄性C57BL/6小鼠Sca-1＋HSC/HPC;检测受体鼠生存时间;外周血白细胞、红细胞比容、血小板的变化;脾湿质量及脾集落数;PCR检测Y染色体（Sry基因）表达确定受体小鼠重建造血的细胞来源。结果与结论：移植组受体鼠30d存活率、白细胞、红细胞比容、血小板、脾湿质量及脾集落数均明显高于对照组（P〈0.05）;Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体。提示Sca-1＋HSC/HPC移植后能重建造血衰竭小鼠造血功能。     

初诊多发性骨髓瘤患者外周血淋巴细胞亚群的检测及意义

目的:通过检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者外周血淋巴细胞亚群评价MM患者机体的免疫功能状态并分析其与患者预后的相关性。方法:采用流式细胞术检测32例初诊MM患者和24例健康献血者的外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg);分别采用溴甲酚绿法、透射免疫比浊法检测患者血清白蛋白(albumin,Alb)、β2-微球蛋白(β2 microglobulin,β2-MG)。结果:与健康献血者比较,MM患者外周血淋巴细胞中CD3~+、CD4~+T淋巴细胞比例无显著改变(P0.05),CD8~+T淋巴细胞、NK细胞比例升高(P0.05),CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值、CD19~+B淋巴细胞比例降低(P0.05),CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T淋巴细胞的比例明显升高(P0.01)。CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T淋巴细胞的比例与MM的疾病分期呈正相关,与MM患者血清中的β2-MG浓度亦呈正相关(P0.05)。结论:MM患者体内在淋巴细胞亚群的异常表达可能与其肿瘤负荷、病情进展及预后有关。CD4~+CD25~+Treg细胞的表达异常可能是MM免疫逃逸的一个重要机制。