核酶对食管癌EC9706细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的 :观察针对人端粒酶RNA模板区的核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法 :利用脂质体Lipofectamine介导 ,将已构建好的带有端粒酶核酶基因的重组质粒pBBS2 12Rz及空载质粒pBBS2 12转染食管癌EC970 6细胞 ,采用TRAP ELISA法检测端粒酶活性 ,用倒置相差显微镜及流式细胞仪观察细胞生长和凋亡情况。结果 :重组质粒pBBS2 12Rz转染的食管癌EC970 6细胞的端粒酶活性明显下降 ,细胞生长速度明显变慢 ,凋亡加速。结论 :端粒酶核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞生长有抑制作用 ,可望成为食管癌基因治疗的新方法     

circLPAR3靶向miR-1238对食管癌细胞放射敏感性的影响

目的:探讨circLPAR3对食管癌细胞放射敏感性的影响及作用机制。方法:收集37例食管癌患者的癌组织和癌旁组织,体外培养食管癌细胞系Eca-109、EC9706和KYSE30及食管上皮细胞HET-1A,RT-qPCR法检测组织和细胞中circLPAR3和miR-1238的表达水平。以Eca-109细胞为研究对象,转染...     

神经导向分子Semaphorin5A在人胃癌形成过程中作用的研究

目的:检测神经导向分子Semaphorin 5A在胃癌组织中表达,并探讨其在胃癌发生过程中的功能作用.方法:使用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测Semaphorin 5A在不同胃癌细胞系中的表达,使用Real-time RT-PCR和蛋白质印迹法检测Semaphorin 5A在30例胃癌组织和对应的胃黏膜组织中的表达;采用RNA干扰技术建立稳定Semaphorin 5A表达抑制胃癌细胞系,使用MTT法、软琼脂克隆形成实验和流式细胞仪分别检测Semaphorin 5A基因沉默后对胃癌细胞增殖、生长和凋亡的影响.结果:Semaphorin 5A mRNA在不同胃癌细胞系中高表达,Semaphorin 5A在30例胃癌组织中的表达水平明显高于对应的正常胃黏膜组织,P＜0.05;Semaphorin 5A表达沉默后能够抑制胃癌细胞的增殖、克隆性生长和促进胃癌细胞的凋亡.结论:Semaphorin 5A在胃癌组织中高表达,通过增强胃癌细胞的增殖、克隆性生长能力和抑制胃癌细胞的凋亡在胃癌的发生过程中发挥着重要作用.     

LNC01852通过调控Bcl-2对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

目的:探究长链非编码RNA LNC01852对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:选取人食管癌细胞系EC9706、KYSE30、TE-13和人食管黏膜上皮细胞系HET-1A为研究对象,分别采用siRNA基因敲减技术、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、MTS细胞增殖实验、克隆形成实验和流式细胞术细胞凋亡实验观察LNC01852对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡能力以及对p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路标志分子mRNA和蛋白表达的影响。结果:qRT-PCR结果表明,人食管癌细胞系中LNC01852的表达较食管黏膜上皮细胞系HET-1A明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;MTS细胞增殖实验、克隆形成实验和流式细胞术细胞凋亡实验结果表明,转染siLNC01852能够明显抑制人食管癌EC9706细胞中LNC01852的表达,同时抑制细胞的增殖能力和菌落形成能力,并促进细胞发生凋亡;此外,qRT-PCR和Western blot结果进一步证实,敲减LNC01852能够明显上调人食管癌EC9706细胞中促凋亡分子p53和Bax的mRNA和蛋白表达,同时明显抑制抗凋亡分子Bcl-2的mRNA和蛋白表达,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:LNC01852通过介导p53-Bcl-2/Bax凋亡信号影响人食管癌细胞增殖和凋亡,提示靶向LNC01852及其下游p53-Bcl-2/Bax凋亡信号,有望为临床食管癌治疗提供新的靶点和理论依据。     

抗失巢凋亡促进食管癌细胞肺转移

目的筛选抗失巢凋亡食管癌细胞亚系,研究抗失巢凋亡与癌细胞转移间的关系。方法采用流式细胞技术检测食管癌细胞系EC9706、KYSE30、YES2和NEC无基质凋亡情况,用Poly-HEMA包被培养板对NEC细胞进行四轮抗失巢凋亡筛选,获得抗失巢凋亡细胞亚系NEC P4。将上述各细胞系经尾静脉接种BALB/c-nu裸鼠,观察各细胞系发生肺转移的情况。结果凋亡频率低的EC9706和KYSE30发生肺转移的能力分别为100%和83%,肺转移灶为121和83。易凋亡的YES2 和NEC细胞肺转移灶为9和7,无明显肉眼转移灶。NEC-P4细胞其发生凋亡的比例由亲本细胞的73.14%减少到18.14%,并可见肉眼转移灶,镜下转移灶是亲本细胞的5倍。结论食管癌细胞抗失巢凋亡与其肺转移能力高度相关,应用抗失巢凋亡筛选可获得高转移能力食管癌细胞。     

逆转录病毒介导p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的观察人类野生型p53(wt p53)基因对人食管癌细胞系的抑制作用.方法用逆转录病毒为载体将外源性wt p53基因导入人食管癌细胞系ECA109,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用.结果 p53在转染细胞ECA109/p53中表达水平提高.外源性wt p53基因的导入和表达能使ECA109细胞的生长速率减低,软琼脂集落形成能力下降,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低,凋亡指数升高,裸鼠体内成瘤能力明显下降.结论逆转录病毒载体介导的外源性野生型p53能够抑制人食管癌细胞生长.     

抑制酰基-辅酶A去饱和酶1表达对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制探讨

目的:检测酰基-辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)在食管鳞癌组织和细胞中的表达,分析其表达下调对食管鳞癌EC1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制.方法:采用免疫组织化学和原位杂交法检测60例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常食管黏膜组织中SCD-1 mRNA和蛋白的表达,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管组织(作为阴性对照)和食管鳞癌细胞株中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.不同浓度SCD-1小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)转染食管鳞癌EC1细胞后,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SCD-1 mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8法检测转染前后EC1细胞增殖的变化,FCM检测转染前后EC1细胞凋亡的改变,蛋白质印迹法检测总Akt、p-Akt、bcl-2和bax蛋白的表达.结果:食管鳞癌组织中SCD-1 mRNA和蛋白表达的阳性率显著高于正常食管黏膜组织(P＜0.05),其表达上调与肿瘤组织分级、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P＜0.05).此外,与正常食管组织相比,食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白表达均显著上调(P＜0.05),其中EC1细胞中SCD-1的表达水平最高.50 nmol/L SCD-1 siRNA能显著下调EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.SCD-1表达下调可显著抑制EC1细胞的增殖,诱导细胞凋亡;同时,显著上调bax蛋白的表达,并下调p-Akt和bcl-2蛋白的表达,但不改变总Akt的表达水平.结论:SCD-1可能在食管鳞癌的发生和发展中具有重要作用,抑制SCD-1的表达有望成为食管鳞癌重要的分子治疗策略之一.     

miR-1246通过靶向GSK3β促进食管癌转移的机制

目的:探讨miRNA-1246(miR-1246)促进食管癌细胞转移的作用及其机制.方法:Realtime-PCR法检测miR-1246在癌旁组织、食管癌组织、正常食管上皮和食管癌细胞系中的表达差异.Transwell侵袭实验观察转染miR-1246 mimics或inhibitors对食管癌细胞EC109转移能力的影响;裸鼠尾静脉转移实验观察稳定表达miR-1246对食管癌转移能力的影响;生物信息学分析miR-1246的候选靶基因为GSK3β,荧光素酶报告基因实验检测过表达miR-1246后EC109细胞中野生型和突变型GSK3β的荧光素酶活性.Westernblot检测miR-1246对GSK3β蛋白表达的影响.结果:食管癌组织中的miR-1246表达显著高于癌旁组织（P<0.05);多个食管癌细胞中miR-1246的表达比正常食管上皮细胞Het-1A明显增高（P<0.05).与阴性对照相比,miR-1246 mimics显著促进EC109细胞的侵袭能力（P<0.05).反之,miR-1246 inhibitors明显抑制EC109细胞的侵袭能力（P<0.05);体内实验发现稳定过表达miR-1246明显升高EC109细胞的肺转移能力.荧光素酶报告基因结果证实miR-1246能够抑制GSK3β的3'-UTR区荧光素酶活性;转染miR-1246后,EC109细胞中的GSK3β蛋白水平明显低于对照组;miR-1246过表达显著抑制GSK3β-wt,而不能抑制GSK3β-mut的蛋白表达.结论:miR-1246能够通过靶向GSK3β促进食管癌转移,抑制miR-1246的表达或增加GSK3β的表达可能是抑制食管癌转移的有效手段.     

microRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨miRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用TaqMan探针实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测50例食管癌患者中新鲜食管癌组织和其相应癌旁正常组织中miRNA-155的表达情况;使用脂质体LipofectamineTM2000转染EC9706细胞上调miRNA-155的表达,利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测转染后细胞的增殖变化,流式细胞仪检测其细胞凋亡率的变化.结果 食管癌组织中miRNA-155的表达水平明显低于与其相应的癌旁正常组织(P=0.000);转染miRNA-155后,miRNA-155转染组EC9706细胞中miRNA-155的表达水平高于对照组和NC组(P﹤0.05);细胞的增殖明显受到抑制,且细胞的凋亡率明显升高.结论 miRNA-155在食管癌组织中呈低表达,上调其表达能够明显抑制食管癌EC9706细胞增殖和诱导其凋亡.     

lncRNA01296 在食管癌组织中的表达及其对食管癌TE-2 细胞增殖和迁移的影响

目的：探究lncRNA01296 在食管癌组织中的表达及其对食管癌TE-2细胞增殖和迁移的影响。方法：收集2017年1 月至2018年9月承德医学院附属医院肿瘤科收治的36例食管癌组织及相应的癌旁组织,并培养人正常食管上皮细胞（HEEC）及人食管癌细胞系ECA109、TE-1 及TE-2。用qPCR检测癌组织及ECA109、TE-1 及TE-2 细胞中lncRNA01296、小核核糖核蛋白A(SNRPA)及神经生长因子（NGF）mRNA的表达水平。重组慢病毒干扰载体转染食管癌细胞系及相应对照细胞系,分别分为干扰1组、干扰2组及对照组,WB实验检测转染后细胞SNRPA 及NGF 蛋白的表达水平,MTS 实验检测转染后TE-2 细胞的增殖能力,Transwell实验检测TE-2 细胞侵袭和迁移能力。结果：lncRNA01296、SNRPA及NGF mRNA在食管癌组织及细胞系中呈高表达（均P<0.01）,且lncRNA01296、SNRPA及NGF mRNA在低分化的TE-2细胞中表达高于其他癌细胞（均P<0.05）。干扰1组和干扰2组lncRNA01296、NGF mRNA表达水平明显低于对照组（均P<0.01）,而SNRPAmRNA表达水平与对照组无明显差异（P>0.05）;干扰1组和干扰2 组SNRPA及NGF蛋白表达水平明显低于对照组（均P<0.01）。敲减48、72 h后,干扰1组及干扰2组TE-2细胞相对增殖能力明显低于对照组（P<0.05或P<0.01）;对照组、干扰1组及干扰2组侵袭细胞数分别为（72.0±6.3）、（36.6±4.3）及（33.9±3.7）个,迁移细胞数分别为（85.2±9.9）、（47.5±8.1）及（43.8±6.5）个,干扰1 组及干扰2 组侵袭及迁移细胞数显著低于对照组（均P<0.01）;结论：lncRNA01296可通过上调SNRPA表达促进NGF介导的食管癌细胞的增殖和迁移,为临床食管癌诊断和治疗提供新的靶点。     

全反式维甲酸对EC9706荷瘤裸鼠抑瘤作用的实验研究

目的：观察全反式维甲酸的体内抗肿瘤作用，探讨其体内抑瘤的作用机制。方法：采用裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤模型进行体内抑瘤实验研究，应用全反式维甲酸10d后处死裸鼠，观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况，测定肿瘤生长抑制率；HE染色对肿瘤组织进行细胞形态学观察，TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡，免疫组织化学法检测凋亡相关基因bax及bcl-2蛋白的表达情况。结果：全反式维甲酸对裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤生长具有明显的抑制作用，抑瘤率达60％以上。组织学观察及TUNEL检测结果显示，肿瘤组织中散在凋亡细胞和凋亡小体。免疫组织化学检测结果显示，凋亡相关基因bax蛋白表达增加，bcl-2蛋白表达下降。结论：全反式维甲酸具有较强的体内抗肿瘤作用，作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

干扰GTPBP4基因对食管癌EC9706细胞放射敏感性影响

目的 探讨沉默GTPBP4基因对人食管癌EC9706细胞系放射敏感性影响。方法 通过GEO数据库分析食管癌患者组织中GTPBP4的表达情况。利用重组质粒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术转染食管癌EC9706细胞系,使细胞中GTPBP4基因沉默,观察GTPBP4基因沉默对EC9706细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法评估基因沉默效果及检测凋亡相关蛋白表达。应用MTT法检测转染后细胞的增殖变化。采用流式细胞术检测干扰GTPBP4基因表达后细胞凋亡变化。应用克隆形成实验检测细胞照射后放射敏感性变化。结果 GEO数据库分析表明GTPBP4基因在人食管癌组织中的表达明显高于正常邻近食管组织(P<0.001)。与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组EC9706细胞的GTPBP4 mRNA及蛋白表达水平明显下降(均 P<0.001),表明质粒成功转染EC9706细胞。MTT检测结果显示干扰组EC9706细胞增殖率受到显著抑制(P<0.001)。流式细胞术结果显示干扰组EC9706细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞凋亡明显增加(P<0.001);凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3、Bax)表达明显升高,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达下降(P<0.001、P=0.001、P=0.0014、P=0.005)。克隆形成实验结果显示干扰组EC9706细胞放射增敏比1.716。结论 GTPBP4基因在人食管癌组织中高表达,RNAi技术可有效抑制EC9706细胞GTPBP4基因表达,从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强细胞对放射线的敏感性。     

食管癌survivin、caspase-3表达与细胞凋亡的关系

目的探讨survivinmRNA、caspase-3蛋白在食管鳞癌中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法分别采用RT-PCR和免疫组化技术检测38例食管鳞癌及其对应的正常组织中survivinmRNA和caspase-3蛋白的表达,运用TUNEL方法检测细胞凋亡。结果73.68%食管鳞癌组织呈survivinmRNA阳性表达,显著高于正常组织,并与食管鳞癌的分化程度、临床分期有关,与年龄、性别、淋巴结转移无关;caspase-3蛋白在食管鳞癌和正常组织中的阳性表达率分别为26.32%和89.47%,差异有显著性,并与食管鳞癌的分化程度有关,与年龄、性别、淋巴结转移和临床分期无关;在食管鳞癌组织中,survivinmRNA和Caspase-3蛋白表达呈负相关;survivinmRNA阳性的食管鳞癌组中细胞凋亡指数明显低于survivinmRNA阴性组,(P<0.01),caspase-3蛋白阳性的食管鳞癌组中平均细胞凋亡指数明显高于caspase-3蛋白阴性组(P<0.01)。结论survivin、caspase-3参与了食管鳞癌的发生、发展,可以作为食管鳞癌预后的指标,survivin通过抑制caspase-3的活性而发挥其抑制细胞凋亡的作用是其主要的分子机制。     

人食管癌相关基因4在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的机制

目的 探讨人食管癌相关基因4(ECRG4)在食管癌中表达缺失的机制.方法 采用聚 合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)和DNA测序的方法检测80对配对食管鳞状细胞癌(ESCC)肿瘤组织和癌旁正常上皮中ECRG4的外显子突变;采用DNA亚硫酸氧盐修饰和序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)检测EC9706细胞系ECRG4基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷或三氧化二砷(As2O3)处理后ECRG4 mRNA的重新表达.结果 80对ESCC配对标本中,ECRG4的4个外显子编码区均未发现突变.EC9706细胞系ECRG4基因核心启动子区16个CpG岛中,有11个呈高甲基化状态,ECRG4 mRNA不表达.EC9706细胞处理前ECRG4 mRNA不表达,去甲基化药物处理后,ECRG4 mRNA均重新表达.结论 甲基化表观遗传学机制是导致ECRG4基因在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的一个机制.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of loss of human esophageal cancer-related gene 4 (ECRG4) expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC.) Methods PCR-SSCP and DNA sequencing analysis were used to detect the mutation of ECRG4 exons in esophageal cancer and matched adjacent normal tissues of 80 patients. DNA bisulfite-modifying ssPCR sequencing assay was used to examine the methylation status of ECRG4 promoter in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells. The re-expression of ECRG4 mRNA was examined by RT-PCR in EC9706 cells, after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Results No mutation in the four ECRG4 exons was found in all the ESCC and matched normal adjacent tissues. RT-PCR showed that 11 of 16 CpG islands of ECRG4 promoter were hypermethylated, while ECRG4 mRNA expression level was undetectable in the EC9706 cells. The ECRG4 mRNA was re-expressed after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Conclusion The epigenetic mechanism of methylation is a reason of loss of ECRG4 gene expression in the ESCC cell line EC9706.     

D10-86 cDNA片段在人食管癌中的表达

目的：D10－86 cDNA片段是通过mRNA差异显示技术分离的在食管癌中低表达的cDNA片段。由于mRNA差异显示技术具有较高的假阳性，故需进一步鉴定其在食管癌中的表达情况。方法：采用RT－PCR方法检测了41对食管癌组织及配对食管癌旁粘膜和食管癌细胞系EC9706和肺癌细胞系GLC82中D10－86 cDNA片段的表达。结果：D10－86 cDNA片段在41．5％（17／41）食管癌组织中的表达明显低于相应的癌旁粘膜，未检测到表达和微弱表达的分别为9．8％（4／41）和31．7％（13／41），食管癌组织中的表达高于相应的癌旁粘膜7．3％（3／41），表达无差别的51．2％（21／41）；在食管癌细胞系EC9706和肺腺癌细胞系GLC82未检测到表达；D10－86 cDNA片段表达下调与食管癌临床病理因素无显著相关性（P＞0．05）。结论：D10－86 cDNA片段在人食管癌中表达下调。     

A cyclooxygase-2 inhibitor NS-398-enhanced apoptosis of esophageal carcinoma cell EC9706 by adjusting expression of survivin and caspase-3

The aim of this study is to examine the effect and mechanism of a selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor NS-398 on inducing apoptosis of esophageal cancer cells. After the treatment with NS-398 on esophageal carcinoma EC9706 cell, MTT assay was used to observe the inhibition of EC9706 cell growth and apoptosis was determined by electronic microscopy and flow cytometry. The expression of survivin and caspase-3 was examined using immunocytochemical technique. The dose of 0.01–0.1 mM NS398 showed the inhibitory effect on growth of EC9706 cell lines and induce apoptosis in a dose- and time-effective manner; moreover, NS-398 also downregulated the level of expression of survivin and elevated the expression of capase-3. NS-398 can induce apoptosis of the esophageal carcinoma EC9706 cells by means of adjusting expression of survivin and caspase-3.     

Survivin基因表达的拷贝数与细胞凋亡的关系

目的:研究胃癌组织中Survivin基因表达的mRNA拷贝数、细胞中蛋白表达及凋亡情况,结合临床资料分析三者间及其与病理的关系,讨论其在胃癌诊断、预后等方面的意义。方法:SurvivinmRNA拷贝数采用分子信标荧光定量PCR方法,以其读码框部分cDNA克隆重组子为标准品进行绝对定量测定;细胞中蛋白表达采用免疫组化方法;细胞凋亡采用TUNEL方法。结果:SurvivinmRNA拷贝数和蛋白表达阳性率,肿瘤组织显著高于正常组织(P<0.05);细胞凋亡指数AI,肿瘤组织显著低于正常组织。肿瘤组织中SurvivinmRNA拷贝数与患者的生存状况和病理类型显著相关,且与AI呈显著负相关(r=-0.252,P<0.05);Survivin蛋白表达阳性率与患者生存状况显著相关,蛋白表达阳性组mRNA拷贝数高于蛋白表达阴性组,AI低于表达阴性组,但无统计学意义(P>0.05);SurvivinmRNA表达和蛋白表达无显著相关性(P>0.05)。结论:SurvivinmRNA和蛋白在胃癌中表达上调,可作为判断预后的生物学指标。     

Bcl-XL反义寡核苷酸增强食管癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的探讨Bcl -XL反义寡核苷酸(ASODN)在下调Bcl- XL表达、增加食管癌细胞株EC9706对5氟尿嘧啶(5Fu)敏感性中的作用。方法设细胞对照组、空白对照组、无关序列寡核苷酸(N ODN)组、ASODN组、5Fu组及ASODN联合5Fu组,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测EC9706细胞的增殖抑制率;RT PCR和Westernblot检测Bcl- XLmRNA和蛋白表达水平的改变;吖啶橙荧光染色和流式细胞技术定量检测EC9706细胞的凋亡率。结果Bcl -XLASODN联合5Fu治疗组对食管癌细胞增殖的抑制率为71.58%,对Bcl XLmRNA表达抑制率为81.25%,并可显著下调Bcl XL的蛋白表达;凋亡指数为69.5%,凋亡率为(63.32±9.23)%,与细胞对照组、空白对照组、N -ODN组、ASODN组及5Fu组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ASODN联合5Fu可有效抑制食管癌细胞EC9706的增殖,通过ASODN下调Bcl XL表达,可显著增强食管癌细胞对5Fu的敏感性。