小干预RNA对人乳头瘤病毒6bE6基因的沉默作用

目的 探讨小干预RNA(siRNA)对稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)6bE6基因的细胞株中靶基因的干预作用。方法 建立并筛选稳定表达靶基因HPV6bE6的阳性细胞株,分别设计同源于HPV6bE6基因的不同序列的4对siRNA,采用实时定量PCR技术检测siRNA转染前后细胞内靶mRNA的表达情况。结果 转染细胞中HPV6bE6基因表达最低有90%以上被抑制,低浓度siRNA水平(1nmol/L~150nmol/L)即能有效抑制靶基因表达,靶mRNA的沉默于转染siRNA后24h达到最强,且至少可维持4d。结论 siRNA-HPV6bE6可以高效、特异地沉默HPV6bE6基因,可能为治疗HPV6b型感染提供实验室依据。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

钙网蛋白基因120片段和人乳头瘤病毒6bE7基因诱导的小鼠细胞免疫反应

目的研究嵌合DNA疫苗钙网蛋白基因120片段(CRT120)和人乳头瘤病毒6b型E7基因(HPV6bE7)的免疫学特性。方法克隆、构建重组质粒即嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／ HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-CRT120;经脂质体转染获得HPV6bE7转染阳性 B16细胞株;用肌内注射法对C57BL/6小鼠进行重组质粒DNA疫苗免疫;检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群变化、小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性以及与靶细胞共孵育后白介素2和干扰素γ的分泌水平。结果获得构建正确的嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／HPV6bE7以及稳定表达HPV6bE7 的阳性细胞株。CRT120／HPV6bE7较之HPV6bE7能引起免疫小鼠外周血中CD8 T淋巴细胞亚群分化和 TCRγδ T细胞上调(P<0．05),脾淋巴细胞与靶细胞共孵育上清液中白介素2和干扰素γ的浓度也明显高于HPV6bE7和CRT120组(P<0．05);CRT120／HPV6bE7免疫的小鼠淋巴细胞对靶细胞B16／HPV6bE7 有明显的杀伤活性。结论 CRT120／HPV6bE7嵌合DNA疫苗能够诱导免疫小鼠的病毒抗原特异性细胞免疫。     

人乳头瘤病毒16 E6/7转基因小鼠模型的建立

目的 构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,通过显微注射法建立HPV16 E6/7转基因小鼠模型。方法 应用基因重组技术,构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,将经线性化的包含启动子、目的基因、PolyA尾的完整的真核表达DNA,通过将外源基因显微注射到供体小鼠受精卵的雄原核中,再植入到假孕受体鼠的输卵管中,获得129只F0代小鼠.常规法提取这些转基因小鼠的基因组DNA,进行PCR分析,得到5只原代转基因小鼠,再进行DNA印迹分析,其中4只小鼠的DNA出现与阳性质粒对照类似的特异条带,说明E6/7整合在这4只小鼠的基因组中。将Founder小鼠与正常FVB配种,后代经PCR检测,统计结果符合孟德尔遗传定律,证明外源基因稳定遗传给后代。在4只5月龄F₀代阳性转基因小鼠中有2只小鼠耳朵皮肤出现不典型增生改变。结果 成功构建了pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,用包含CMV启动子、HPV16 E6/7目的基因转基因的小鼠已出现皮肤组织不典型增生。结论 获得可繁殖传代的整合了HPV16 E6/7基因的转基因小鼠模型。     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.     

发夹状RNA对人乳头瘤病毒16型E6表达的影响

目的 研究发夹状RNA对人乳头瘤病毒(HPV)E6基因表达的影响。方法 构建发夹状RNA、正义RNA及反义RNA表达质粒,重组体转入人宫颈癌细胞株CaSKi,应用RT-PCR及蛋白印迹法检测其对CaSKi细胞E6mRNA及蛋白表达的影响。结果 发夹状RNA表达质粒的导入明显下调了E6mRNA及蛋白表达,发现含有发夹状RNA的HPV-E6mRNA表达水平相当于空白对照组的14.6%,蛋白表达水平相当于空白对照组的23.3%,此效果优于传统的反义RNA。结论 利用发夹状RNA的干扰技术可有效抑制靶基因的表达。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的 建立稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）16E7蛋白的HaCaT细胞株。方法 利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HPV16E7。将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定。结果 经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1（+）-HPV16E7成功。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达。结论 成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株。     

人乳头瘤病毒6b型早期蛋白E6和E7基因的克隆及表达

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列分析比对及原核表达,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增HPV-6的E6、E7基因,构建pUCHPV-6E6、pUCHPV-6E7两个重组体,酶切鉴定及测序分析比对。经双酶切与表达载体pGEX-5X-1定向连接,构建pGEX-5X-l重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导GST融合蛋白表达及Westernblot鉴定。结果:克隆出HPV-6b早期蛋白E6、E7基因,成功构建pUCmHPV-6bE6、pUCmHPV-6bE7重组质粒,克隆获得HPV-6bE6、E7基因与GenBank标准株序列完全相同,经双酶切定向克隆,成功构建重组表达质粒pGEX-5X-lHPV-6bE6和pGEX-5X-lHPV-6bE7,转入BL21大肠杆菌,高效表达GST融合蛋白。结论:本研究克隆出的HPV-6bE6、E7基因与标准株相同,HPV-6bE6、E7GST融合蛋白获得高效表达,为HPV-6bE6、E7基因表达产物的纯化、体外活性以及E6、E7为靶位的基因疫苗研究奠定基础。     

16型人乳头瘤病毒E6/E7诱导角质形成细胞表达热休克蛋白70

目的 了解１６型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ１６）Ｅ６／Ｅ７、ＨＳＰ７０与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法进行转染,以Ｇ４１８筛选阳性克隆,免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对ＨＳＰ７０和ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染然质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常负擀形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量７００００处出现一条染色带     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

Recombined DNA vaccines encoding calreticulin linked to HPV6bE7 enhance immune response and inhibit angiogenic activity in B16 melanoma mouse model expressing HPV 6bE7 antigen

Calreticulin (CRT) has been reported to have an effect of upregulating MHC class I presentation as well as inhibiting angiogenesis in vitro and in vivo. Combination of dual mechanisms of enhanced immunogenicity of human papillomavirus (HPV) 6bE7 antigen and antiangiogenesis may be introduced in the strategy of vaccines against condyloma acuminatum (CA) resulting from HPV infection. Therefore, we constructed DNA vaccines by employing different lengths of CRT chimerically linked to a model antigen HPV6bE7 and investigated the immunological and antiangiogenic effects of these vaccines in a B16 melanoma model that express HPV6bE7 antigen. Our results showed that vaccination with CRT180/HPV6bE7 or CRT120/HPV6bE7 enhanced the presence of CD8⁺ T cells and TCRγδ T cells in vivo, increased the specific lysis activity against E7-expressing cells and secretion levels of IL-2 and IFN-γ by activating T cells in vitro significantly. Moreover, recombined CRT180 or CRT120 with HPV6bE7 vaccines could elicit a more efficient E7-specific immune response than HPV6bE7 alone. The similarity of immunological enhancement of CRT180/HPV6bE7 and CRT120/HPV6bE7 implies that the immunologically active region mainly exist in fragment 1–120 aa. Furthermore, CRT180/HPV6bE7 and CRT180 displayed remarkable superiority over CRT120/HPV6bE7 in vivo angiogenesis assay, suggesting that the antiangiogenic activity of CRT resides in a domain between aa 120 and 180. Vaccination with CRT180/HPV6bE7 generated the best protective effect of delaying tumor formation and reduction of tumor size in tumor growth inhibition experiment among all DNA constructs. Therefore, CRT180/HPV6bE7 vaccine may enhance the immunological response to HPV6bE7 and inhibit angiogenesis. This construct may be useful in preventing HPV-associated dermatosis and may be developed as a promising strategy to control CA.     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。