EGF和bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对Tau和神经元特异性烯醇化酶表达的影响

目的：观察表皮细胞生长因子（BGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经细胞后,神经元微管相关蛋白Tau和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。方法：取P4代MSCs分为EGF、bFGF和EGF＋bFGF及对照组;免疫细胞化学法检测Tau蛋白和NSE表达,ELISA法分析各组细胞Tau蛋白含量。结果：免疫细胞化学检测显示EGF＋bFGF811Tau蛋白和神经元特异性烯醇化酶NSE阳性细胞率最高,bFGF组、EGF组和对照组依序递减;各组Tau蛋白含量结果与Tau蛋白阳性细胞率一致。结论：EGF和bFGF均可促进MSCs向神经细胞分化,并表达Tau蛋白和NSE,二者具有协同作用。     

不同诱导因子对人脐带血非造血干细胞神经分化的影响

目的 探讨诱导人脐带血非造血干细胞向神经细胞分化的最佳条件.方法 通过密度梯度离心法原代培养脐带血非造血干细胞;用流式细胞术分析脐带血获得的贴壁细胞的CD34、CD90、CDl66、HLA-ABC、HLA-DR等免疫表型;并用不同诱导因子组合:1.维甲酸(RA);2.表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);3RA EGF bFGF;4二甲基亚砜(DMSO) 丁羟基茴香醚(BHA)诱导后,用免疫荧光化学法检测各组脐带血非造血干细胞中β-微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖苷酶-C(Gal-C)等神经细胞、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性标记抗原的表达.结果 脐带血非造血干细胞CD90、CD166、HLA-ABC表达阳性;无论那一种诱导因子组合,分化为少突胶质细胞的比率均高于神经元及星型胶质细胞;即各组分化为少突胶质细胞数＞神经元的细胞数＞星型胶质细胞数.对于少突胶质细胞(Ga-C)以RA EGF bFGF组合诱导率最高,达57.02%,其次是DMSO BHA诱导组.而对于神经元及星型胶质细胞的分化各组比较,以RA组最高,其次是DMSO BHA诱导组合.结论 RA对神经元及星型胶质细胞的诱导作用较好,而RA EGF bFGF组合对于少突胶质细胞诱导作用最明显.     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

碱性成纤维细胞生长因子和5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞分化潜能和细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和5-氮杂胞苷(5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,在倒置相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期改变;MTT法检测bFGF和5-aga对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测actin、desmin、myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化;MSCs经5-aza以及5-aza加bFGF联合诱导actin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高;而经bFGF诱导后,前4种蛋白表达无明显变化,仅GFAP蛋白表达显著增高。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,而bFGF有明显促增殖作用。MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞,bFGF可使MSCs分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。     

bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法：从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞，进行原代培养，分为bFGF组、EGF组、bFGF＋EGF组及对照组：培养过程中观察干细胞的生长，培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞，培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果：取材细胞大部分为nestin免疫阳性细胞；各实验组均可促进培养细胞的生长和分 化。免疫组化中，EGF使神经干细胞增殖成团，增加GFAP的表达（P＜0．01）；bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P＜0．01）；两种因子联合应用，神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P＜0．01）。结论：EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长，在分化方面，EGF倾向于诱导干细胞增并向着胶质细胞分化，bFGF则诱导干细胞分 成更多的神经元。     

来源于大鼠脊髓星形胶质细胞的神经干细胞的增殖分化特性

目的:通过研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在A-NSC培养中的作用来观察其增殖特性;通过添加血小板生长因子PDGF-AA作为诱导因子来研究A-NSC分化的特性。方法:将A-NSC分四组:bFGF+EGF添加组,bFGF添加组,EGF添加组和对照组进行培养,通过形态观察和流式细胞仪检测细胞周期。同时添加PDGF-AA诱导A-NSC分化,以自然分化为对照组,通过免疫荧光染色观察比较其各类细胞分化比例的差异。结果:可观察到A-NSC在bFGF添加组和bFGF+EGF添加组有正常的分裂周期,而EGF添加组和对照组的细胞几乎都停滞在G0/G1期,显示其增殖受到阻滞;诱导实验检测到对照组细胞的分化比例分别为神经元(89.0±4.2)%,星形胶质细胞(4.6±3.2)%,少突胶质细胞(7.6%±2.5%),具有很高的神经元分化比例;诱导组细胞的分化比例分别为神经元(80.6±4.1)%,星形胶质细胞(3.0±1.3)%,少突胶质细胞(20.6±1.8)%,诱导组分化成少突胶质细胞的能力有显著提高(P<0.001)。结论:在A-NSC的生长过程中,bFGF对A-NSC的增殖起重要作用,在本实验条件下A-NSC倾向于向神经元分化,同时PDGF-AA能够显著诱导A-NSC分化成少突胶质细胞。     

丹参素联合生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究

人脐血间充质干细胞(MSCs)是从脐带血中分离和培养的一种多潜能成体干细胞。本实验通过密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,贴壁法筛选出脐血MSCs,体外扩增,免疫荧光方法检测表面抗原。传3代的脐血MSCs经20ng/mlbFGF预诱导24h、3μg/μl丹参素诱导6h、20ng/mlEGF和20ng/mlbFGF诱导分化5d后出现类似神经元样细胞的形态改变,伸出长突起。免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志NeuN和β-TubulinⅢ,而星形胶质细胞特异性标志GFAP阳性细胞较少。上述结果表明,丹参素联合生长因子EGF和bFGF在体外可定向诱导人脐血MSCs分化为神经元样细胞。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

人脐血MSCs向神经元样细胞分化过程中neurogenin1的表达变化

目的: 探讨人脐血间质干细胞(MSCs)体外向神经元样细胞分化过程中neurogenin 1的表达变化。方法: 常规从人脐血中分离MSCs,采用生长因子EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测诱导前、后神经元表面标志蛋白NF-M、NSE、胶质细胞标志蛋白GFAP和neurogenin 1的表达情况;Western blotting和RT-PCR法检测诱导前、后人脐血MSCs中neurogenin 1蛋白和mRNA的表达变化。结果: 诱导前,人脐血MSCs不表达NF-M、NSE和GFAP;诱导7 d,人脐血MSCs可以分化为神经元样细胞, 同时表达NF-M、NSE和GFAP。诱导前,人脐血MSCs不表达neurogenin 1,诱导后neurogenin 1蛋白和mRNA表达显著增加。结论: Neurogenin 1可能参与了体外诱导人脐血MSCs向神经细胞分化的过程。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞

目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞。方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析。结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长。免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂。RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致。结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞。     

嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。     

A high concentration of epidermal growth factor increases the growth and survival of neurogenic radial glial cells within human neurosphere cultures

Human neural progenitor cells (hNPC) isolated from the fetal cortex can be expanded as aggregates of cells termed neurospheres. Traditional methods have used 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF) to drive the proliferation of these cells. Here, we show that 100 ng/ml EGF can significantly increase growth rates of hNPC at later passages. This was through increased survival of dividing cells rather than increased proliferation and associated with prolonged activation of ErbB2 and phosphorylated Akt. High EGF also resulted in a larger proportion of elongated "radial glial"-like cells within the growing neurospheres and increased expression of the radial glial markers. The number of new neurons generated from cultures maintained in 100 ng/ml EGF was significantly higher than from 20 ng/ml EGF. Thus, high concentrations of EGF increase the survival of a highly neurogenic human radial glial cell.     

神经调节蛋白-1与碱性成纤维细胞生长因子对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨神经调节蛋白-1(NRG-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:从新生大鼠大脑组织分离NSCs,进行体外培养,分别用bFGF、 NRG-1和NRG-1加bFGF处理,观察各组神经球的形成情况;应用免疫细胞化学法鉴定NSCs及检测分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、 2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)的表达.结果:NRG+bFGF组和bFGF组形成的神经球数量和直径的差别不明显,但都明显多于和大于NRG组和对照组.免疫细胞化学显色结果显示,NRG+bFGF组、bFGF组中的神经球分化出的NSE、 GFAP、 CNP阳性细胞数量明显多于NRG组和对照组,尤其是NRG+bFGF组分化的NSE、CNP阳性细胞的突起较bFGF组更长和增多.结论:NRG-1与bFGF合用能促进NSCs的增殖和分化,促进分化的神经元、少突胶质细胞突起的生长.     

Immunohistochemical characterization of the rat carotid body

We studied the histochemical phenotype of carotid body (CB) cells in the adult rat. In addition to tyrosine hydroxylase (TH), type I cells expressed numerous growth factors such as glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), basic fibroblast growth factor (bFGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), insulin-like growth factor-I (IGF-I), epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha), as well as the receptors p75, Ret, epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor-alpha (PDGFR-alpha). Type II cells expressed the glial fibrillary acid protein (GFAP), vimentin, the trophic factor bFGF and receptors p75, EGFR and PDGFR-alpha. Both types I and II cells exhibited a positive immunoreaction to markers of neural progenitor cells such as the polysialylated form of the neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) and nestin, respectively, suggesting that CB contain some immature cells even at the adult stage. The possibility that these cells can be expanded and differentiated into mature neurons should be explored.     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。