2型、5型腺病毒DNA与12型腺病毒DNA、大肠杆菌DNA序列的对比研究

目的通过对2型、5型人腺病毒DNA（Adv2、5 DNA）与Adv12 DNA及大肠杆菌DNA（EC DNA）序列进行对比研究,确定Adv2、5 DNA中能够拈抗细菌DNA的可能的活性片段——抑制性CpG寡核苷酸（CpG-N ODN）。方法从NCBI核酸数据库中获取Adv2、5、12 DNA和EC DNA序列,采用DNATools、BioEdit等软件对Adv2、5、12 DNA和EC DNA进行序列分析和比较,确定Adv2、5 DNA特征性的CpG基序,查找出Adv2、5 DNA中以上述CpG基序为核心的12碱基寡核苷酸（12-ODN）。结果确定了19种Adv2、5 DNA特征性的CpG基序,Adv2、5 DNA中以这19种CpG基序为核心的12-ODN共504条。结论504条12-ODN可能是Adv2、5 DNA的CpG-N ODN。     

细菌随机扩增多态性DNA分析中模板提取方法的优化

目的：筛选出最佳模板最方法用于随机扩增多态性DNA（RAPD）,方法：对4种方法（挑丝法,沉淀法,加热裂解和裂解剂裂解法）提取的模板DNA进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线扫描及随机扩增多态性DNA,比较其片段大小,纯度及RAPD指纹图差异,结果：挑丝法和沉淀法均可提取出大于23kb且纯度较高的模板NDA,二者指纹图完全一致且均有2－4kb的较大片段,加热裂解法和裂解法提取的模板有弥散,碎裂的DNA并纯度较差,指纹图上仅有600－2000bp的较小片段,结论：用挑丝示或沉淀法提取的模板NDA最适于进行PAPD。     

细菌脂多糖、脂蛋白和DNA体内协同致病作用观察

目的观察细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、脂蛋白（bacterial lipoprotein，BLP）及其DNA[鸟嘌呤二核苷酸（CpG）寡核苷酸（oligonueleoetide），CpG—ODN]的体内协同致病作用。方法147只小鼠随机分为等渗盐水对照组、单纯LPS组、单纯CpG—ODN组、单纯BLP组、LPS＋BLP组、LPS＋CpG—ODN组和LPS＋BLP＋CpG—ODN组，尾静脉注射给药，观察小鼠死亡率及血清肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。结果注射后12，24，48h，二联组的死亡率显著高于单独给药组（P〈0．05或P〈0．01）；三联给药组各时相点死亡率显著高于二联组（P〈0．05）。单独给药后6h，TNF—α水平均显著高于对照组（P〈0．05），12，24h与对照组比较，差异无统计学意义。二联组与单因素组和对照组比较，6，12h血TNF—α均明显升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。三者联合刺激时，6，12h血TNF-α与二联组比较，差异有统计学意义（P〈0．05），至24h仍显著高于对照组（P〈0．05）．结论细菌LPS、细菌脂蛋白和细菌DNA不仅自身存在一定的致病能力，而且三者间具有明显的协同效应，特别是三者联合给药时作用最强。     

CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展

经黏膜免疫因其简便易行、可同时激发黏膜免疫和系统免疫应答等优点受到极大关注。但由于存在黏膜屏障,能有效介导黏膜免疫应答的佐剂已成为研究热点。在诸多在研佐剂中,CpG ODN具有极强的黏膜免疫激活作用,诱导以Th1型为主的免疫应答,具有广阔的应用前景,本文综述了CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展。     

基于23S rDNA基因的病原细菌通用检测寡核苷酸芯片

目的 :利用新兴的生物芯片技术 ,以细菌 2 3SrDNA基因为靶序列 ,实现常见病原细菌的通用检测。方法 :从核酸数据库中调用一些病原细菌的 2 3SrDNA基因序列 ,在指定的片段内设计目的细菌的种特异性寡核苷酸探针 ,用适当的方法固定在玻片上 ,制备寡核苷酸芯片 ;扩增实验细菌 2 3SrDNA基因片段 ,并同时完成荧光素的掺入标记 ,标记扩增产物纯化后 ,与芯片进行杂交 ,根据杂交结果进行条件优化及芯片评价。结果 :通过对探针、固定化、标记、杂交等条件进行优化 ,本实验中所使用的多种实验细菌可以在 4h左右通过杂交得到准确鉴定 ;以奇异变形杆菌为对象 ,本系统最低检出菌液浓度为 10 0个 ml,即反应体系中含 10个菌体即可检出。结论 :本研究建立的寡核苷酸芯片系统可以稳定而特异地实现多种细菌的通用检测 ,具有良好的应用前景。     

用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA

目的：用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法：用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌，利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至Ⅳ基因长约2100bp的DNA序列，并用kil-N序列中含有的单一酶切位点Xho Ⅰ对混合质粒进行酶切，取酶切产物转化W3110感受态细胞，菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果：在没有任何筛选标记的情况下，用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论：该方法操作简单、精确，能够避免引入新突变。为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。     

CpG ODNs的免疫活性作用与肿瘤治疗的研究进展

CpG ODNs(CpG oligodeoxynucleotides,CpGODNs)是近年来研究的热点,特别是对难以攻克恶性肿瘤,其有效性引起了国内外医学界的重视。CpG ODNs是一个作用强大的免疫调节剂和免疫佐剂,且动物实验和临床研究表明无明显的毒副作用。本文就CpG ODNs的免疫活性作用及其在肿瘤治疗中的研究作一综述。1 CpG ODNs的基序及其活性CpG二核苷酸在细菌和无脊椎动物基因组中均以预期的频率出现。在细菌基因组DNA中,CpG出现频率为1/16,即每16个二核苷酸中有一个CpG二核苷酸;而在脊椎动物中则表现为CpG抑制(CpG suppression),即出现频率仅为细…     

烧伤感染病原菌的DNA微阵列检测研究

目的观察DNA微阵列检测烧伤感染病原菌的灵敏度和特异度。方法分别采用DNA微阵列法和常规培养分离鉴定法对不同含菌量的菌液进行检测,比较二者鉴定病原菌的灵敏度;采用微阵列法检测经常规方法鉴定明确的烧伤感染病原菌62株,观察二者的阳性符合率和阴性符合率;采用上述两种方法检测103份烧伤创面分泌物标本,观察其符合率。结果与常规方法相比,DNA微阵列检测烧伤创面细菌具有快捷、高通量的优势,鉴定单一菌株的灵敏度比常规方法高10~100倍,鉴定已知菌株与常规方法的阳性符合率和阴性符合率均为100%;在检测103份烧伤创面分泌物时,DNA微阵列除鉴定出常规方法鉴定出的所有菌株外,还检出了一些常规方法未检出的菌株。结论与常规方法相比,DNA微阵列检测烧伤感染常见病原菌的符合率和灵敏度均达到较高水平,具有良好的临床应用前景。     

一种细菌DNA提取方法的正交设计优化

目的通过正交实验优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的方法,以缩短其提取时间,进而缩短细菌特别是炭疽芽孢杆菌等恐怖细菌的核酸分子检测时间。方法以基因芯片的杂交信号值为指标,以异硫氰酸胍-硅胶提取DNA过程中的煮沸时间、室温放置时间、乙醇洗涤次数为考察因素通过正交实验法优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的条件。结果优化后的因素水平为煮沸10 min,室温放置15 min,乙醇洗涤2次。结论实验证明,优化后的提取时间比原来缩短了25 min,且信号值比原方法更高。     

DNA同源重组修复的分子机制

电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA的损伤，DNA的损伤类型很多，其中以DNA双链断裂（double strand break，DSB）最为严重。DNA DSB的修复较其他类型的DNA损伤更加困难。不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡，而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等，从而易于形成肿瘤等疾病。DNA损伤的不完全修复可导致基因组不稳定，机体细胞为了对抗损伤，发展出多个修复系统来保证基因组的完整性，同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）是DNA DSB损伤修复的主要方式，对于保持哺乳动物细胞的基因组完整性十分重要。重组即遗传物质的重排，同源重组是指发生在同源DNA序列间的重组，主要是利用DNA序列间的同源性来识别，而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。     

新CpG寡聚脱氧核苷酸体内抗肿瘤与增强免疫活性研究

目的:探讨新设计CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)在小鼠体内的抗肿瘤作用及其对荷瘤小鼠免疫功能的影响.方法:建立C57BL/6小鼠腹腔、皮下荷黑素瘤肿瘤模型,腹腔注射CpG ODN,观察荷瘤鼠生存时间、肿瘤生长曲线,计算抑瘤率.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中白细胞介素(IL)12和免疫球蛋白E(IgE)含量;3H-TDR掺入法检测脾脏B细胞、T细胞增殖活性;51Cr释放法检测NK细胞杀伤活性;中性红法检测腹腔巨噬细胞吞噬功能.结果:CpG10,CpG11能明显延长腹腔接种肿瘤小鼠的生存时间,与阳性对照CpG1826相比P＜0.01;二者平均抑瘤率(皮下荷瘤鼠)分别为(55.2±2.3)%与(40.7±1.7)%,显著高于CpG 1826 [抑瘤率(17.8±7.6) %](P＜0.05,P＜0.01).CpG10/CpG11可促使荷瘤小鼠血清IL-12含量显著升高( P＜0.01),IgE含量显著下降( P＜0.01);明显刺激B细胞、T细胞增殖能力以及NK细胞的杀伤活性( P＜0.01),对腹腔巨噬细胞的吞噬功能有显著提高( P＜0.01).CpG10免疫增强活性较CpG1826更强( P＜0.05).结论:CpG ODN能激活荷瘤鼠抗肿瘤免疫反应,从而抑制小鼠黑素瘤的生长,新结构寡核苷酸的CpG10呈现优于阳性对照的良好抗肿瘤免疫效应.     

CpG寡脱氧核苷酸为佐剂的丙型肝炎生物治疗研究进展

丙型肝炎严重威胁人类健康,并在全球范围内流行,目前尚无有效办法预防和治疗丙型肝炎病毒感染,胞苷酸鸟苷（CpG）寡脱氧核苷酸（CpGODN）作为一类较强的免疫调节佐剂,能够广泛诱导交叉中和性抗体和细胞免疫反应,对丙型肝炎病毒感染具有治疗作用。本文对以CpGODN为佐剂的丙型肝炎生物治疗研究进展予以综述。     

Validation of a novel fluorescent probe-based real-time PCR assay to detect saliva-specific unmethylated CpG sites for saliva identification

The identification of saliva from forensic samples is often important to establish what happened at a crime scene, especially in sexual assault cases. Recently, CpG sites that are specifically methylated or unmethylated in saliva have been reported as markers for saliva identification. In this study, we designed a fluorescent probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for analyzing the methylation status of two neighboring CpG sites, which we previously found were saliva-specifically unmethylated. Specificity analysis using various types of body fluid/tissue samples demonstrated a probe detecting the unmethylation of the two CpG sites reacted only to saliva DNA, indicating this probe as an all-or-nothing marker for the presence of saliva DNA. Sensitivity analysis demonstrated that the detection limit was 0.5 ng saliva DNA as input for bisulfite conversion, while we confirmed a negative effect of larger amounts of non-saliva DNA on sensitivity in the analysis of saliva–vaginal DNA mixtures. We finally validated the applicability of this test to swabs from licked skin and bottles after drinking as mock forensic samples in comparison with other saliva-specific markers. We confirmed the potential usefulness of this test for skin samples, from which a saliva-specific mRNA was not detected reliably, while the ingredients in several beverages might affect methylation analysis. Given the simplicity of real-time PCR as well as the high specificity and sensitivity of the test, we believe the developed method is suitable for routine forensic analysis and can play an important role in saliva identification.     

臭氧治疗细菌性阴道病的疗效评价

目的 评价臭氧治疗细菌性阴道病的有效性和安全性.方法 采用随机对照、开放设计的方法,收集在中山大学附属第三医院就诊的细菌性阴道病患者72例,其中试验组36例接受臭氧治疗,对照组36例接受甲硝唑栓治疗,于治疗结束后第3天观察临床症状及体征变化,并运用BV蓝快速诊断试剂检测阴道分泌物.结果 治疗结束后第3天,试验组和对照组的治愈率分别为61.1%和63.4%,有效率分别为80.6%和88.9%,症状平均缓解时间分别为3.72天和3.53天,阴道分泌物BV蓝检测阴转率均为100%.两组之间比较差异均无显著性(P＞0.05).72例中无不良事件与严重不良事件发生.结论 臭氧治疗细菌性阴道病安全、有效.     

含非甲基化二核苷酸的寡脱氧核苷酸1826对Lewis肺癌放疗联合作用及其剂量-效应关系

目的 探讨含非甲基化二核苷酸的寡脱氧核苷酸( unmethylated cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide,CpG ODN) 1826对X射线照射荷瘤小鼠Lewis肺癌的联合作用及其剂量-效应关系.方法 在C57BL/6J纯系小鼠右前腋窝接种Lewis肺癌细胞,制备荷瘤小鼠模型.将64只荷瘤小鼠按完全随机化方法随机分为对照组、X射线照射(IR)组、低剂量CpG ODN1826组(0.15 mg)、中剂量CpG ODN1826组(0.30 rag)、高剂量CpG ODN1826组(0.45 mg)、低剂量CpG ODN826+ IR组(CPG1826 0.15 mg+ IR)、中剂量CpG ODN1826+ IR组(CpG 0.30 mg+ IR)和高剂量CpG ODN1826+ IR组(CpG 0.45 mg+ IR),每组8只.实验的第1、2、9天注射CpG ODN1826.实验的第2天开始X射线照射,1次/d,2.50 Gy/次,总剂量12.50 Gy.观察各组移植瘤生长速度和各治疗组肿瘤生长延迟时间(TGD),用DNA断裂的原位末端标记法检测细胞凋亡.结果 成功建立荷瘤小鼠Lewis肺癌模型,成瘤率为100％.经治疗后,各组小鼠肿瘤体积都较对照组明显减小,CpG ODN1826 0.45 mg+ IR组移植瘤体积最小.DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)法检测细胞凋亡率分别为(2.40±0.55)％、(5.50±0.76)％、(7.13±0.83)％、(11.63±1.06)％、(19.13±0.83)％、(12.88±0.83)％、(20.57±2.37)％和(28.17±3.31)％.各治疗组都明显高于对照组(t=11.15、7.91、17.82、39.48、24.73、16.61和17.05,P＜0.05),不同剂量CpG ODN1826 +IR组显著高于IR组(t=13.78、15.08和17.47,P ＜0.05)和不同剂量CpG ODN1826组(t=18.53、9.66和7.51,P ＜0.05).结论 CpG ODN1826能明显地抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,且呈剂量-效应关系.     

促红细胞生成素对新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型肠损伤及细菌易位的影响

目的 观察促红细胞生成素(EPO)对新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型肠组织病理改变及细菌易位(BT)的影响,探讨EPO对NEC的保护作用.方法 选取75只3日龄SD大鼠,随机分为正常对照组、NEC模型组和EPO干预组(n=25).采用鼠乳代用品人工喂养及缺氧冷刺激的方法建立新生大鼠NEC模型;EPO干预组建模后在代乳品中添加EPO(0.1U/ml)进行干预;正常对照组以鼠乳喂养,不进行任何干预.第4天心脏穿刺采血后处死大鼠,留取近回盲部末端回肠2cm,HE染色后观察肠组织病理学变化并行组织损伤评分(组织学评分≥2判定为NEC).应用实时荧光定量PCR检测血标本中细菌16S rRNA基因进而计算肠道细菌易位发生率.结果 与NEC模型组比较,EPO干预组肠组织病理评分平均秩和(39.4583 vs 53.8696)、NEC发病率[25％(6/24)υs 57％(13/23)]及细菌易位发生率[17％(4/24)υs 65％(15/23)]均明显降低(P＜0.05,P＜0.01).结论 经肠道补充EPO可有效减轻NEC动物模型肠损伤,降低NEC发病率,减少细菌易位的发生.     

DNA methylation-based age prediction from saliva: High age predictability by combination of 7 CpG markers

DNA methylation is currently one of the most promising age-predictive biomarkers. Many studies have reported DNA methylation-based age predictive models, but most of these are based on DNA methylation patterns from blood. Only a few studies have examined age-predictive DNA patterns in saliva, which is one of the most frequently-encountered body fluids at crime scenes. In this study, we generated genome-wide DNA methylation profiles of saliva from 54 individuals and identified CpG markers that showed a high correlation between methylation and age. Because the age-associated marker candidates from saliva differed from those of blood, we investigated DNA methylation patterns of 6 age-associated CpG marker candidates (cg00481951, cg19671120, cg14361627, cg08928145, cg12757011, and cg07547549 of the SST, CNGA3, KLF14, TSSK6, TBR1, and SLC12A5 genes, respectively) in addition to a cell type-specific CpG marker (cg18384097 of the PTPN7 gene) in an independent set of saliva samples obtained from 226 individuals aged 18 to 65 years. Multiplex methylation SNaPshot reactions were used to generate the data. We then generated a linear regression model with age information and the methylation profile from the 113 training samples. The model exhibited a 94.5% correlation between predicted and chronological age with a mean absolute deviation (MAD) from chronological age of 3.13 years. In subsequent validation using 113 test samples, we also observed a high correlation between predicted and chronological age (Spearman’s rho = 0.952, MAD from chronological age = 3.15 years). The model composed of 7 selected CpG sites enabled age prediction in saliva with high accuracy, which will be useful in saliva analysis for investigative leads.