风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

山东省正常人群风疹病毒IgG的检测

目的了解山东省正常人群风疹病毒自然感染状况,为保护易感人群及制定合理的预防接种方案提供科学依据。方法采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测山东省部分地区正常人群血清中风疹病毒特异性抗体IgG。结果该人群RV-IgG阳性率为80.20%,其中,≤20岁组人群抗体的阳性率为66.87%,>20岁组人群抗体阳性率为82.86%,差异有统计学意义(P<0.05);男性人群抗体阳性率为77.37%,女性人群的抗体阳性率为83.37%,差异有显著性意义(P<0.05);不同职业及不同地区人群抗体阳性率的差异亦均有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。结论低龄儿童和青少年风疹免疫水平较低,是风疹免疫的主要对象。育龄妇女也是风疹免疫的重点对象。不同的工作环境和生活习惯对风疹病毒的感染率有一定的影响。     

ELISA法检测放射工作人员风疹病毒感染的研究

目的 用一种快速检测抗风疹病毒抗体的诊断方法,了解放射工作人员风疹感染情况。方法 应用改良的间接ELISA法,对放射工作人员进行风疹病毒特异性抗体IgG和IgM检测。结果 济南地区514名放射工作人员中90.47%对风疹病毒具有抵抗力,6.42%为易感者,2.33%为原发感染,0.78%为再次感染风疹病毒。结论 放射工作人员的风疹抗体还存在一定的免疫空白,建议对他们开展疫苗免疫,消除风疹感染的危险性。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

汉坦病毒G1糖蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的 构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白的毕赤酵母表达系统.方法 应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码G1包膜糖蛋白的基因,将扩增产物分别与pMD 18-T simple载体连接,经序列分析后双酶切,定向克隆入载体pPICZoαA,继而用BstXI酶切线性化重组质粒并电转化入P.pastoris X33感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定.结果 PCR扩增产物Z10株为1 937bp、L99株为1 991bp,与T载体相连测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.5％和99.7％,其编码蛋白质二级结构均无改变.定向克隆毕赤酵母表达载体获得pPICZαA-Z10G1和pPICZαA-L99G1,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10G1和PpX33-L99G1,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符.结论 成功构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础.     

间接免疫荧光试验在检测风疹病毒感染中的应用

目的建立检测风疹病毒(RV)抗原E1、E2、C的间接免疫荧光试验(IFA),为快速、敏感地检测临床标本中的RV提供一种重要的检测手段。方法采用荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体,检测病毒抗原与抗风疹病毒衣壳蛋白E1、E2、C蛋白的单克隆抗体的结合物。用该系统测定中国麻疹实验室网络送检的咽拭子标本,并与病毒分离结果和临床诊断进行比较。结果IFA方法可以快速、敏感地检测临床标本中的RV。经检测咽拭子标本38份,其中28份采集于临床诊断风疹病例;6例采集于出疹患者,但诊断不明;4份采集于风疹病例的接触者。检测结果有22份风疹阳性标本。IFA的结果与病毒分离结果完全一致,但与临床诊断不一致,IFA结果的阳性数低于临床诊断风疹病例数。结论IFA方法简单可行、敏感特异,结果易于判断,是中国麻疹实验室网络中进行RV检测的重要方法之一。同时IFA方法也可以作为临床快速诊断RV感染的备选方法之一。     

原核表达HPV16 L1蛋白ELISA方法检测血清抗体

目的:从感染人乳头瘤病毒(HPV)的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长,构建原核表达载体,表达并纯化蛋白用于ELISA检测。方法:根据基因序列设计一对特异引物,用PCR的方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,以pet28a为载体构建表达质粒,IPTG诱导表达蛋白,DEAE及葡聚糖凝胶分离纯化目的蛋白,将蛋白包被平底96孔板用于ELISA检测。结果:从宫颈癌临床标本克隆到HPV16型L1蛋白编码序列,其原核表达产物纯化后可用于ELISA检测。结论:成功获得人有抗原性的HPV16L1蛋白,可用于ELISA检测。     

2019年河南省1E基因型风疹病毒结构蛋白基因特征分析

目的 分析2019年河南省1E基因型风疹病毒分离株结构蛋白基因特征,探讨抗原位点变异情况,为河南省风疹防控提供支持.方法 对河南省2019年风疹病毒分离株采用RT-PCR方法扩增结构蛋白基因片段并测序,截取C、E2、E1蛋白序列,使用Mega7.0.26软件进行进化树分析、同源性分析和氨基酸特征分析.结果 对5株1E基...     

实时荧光PCR检测风疹病毒的应用研究

目的建立风疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的快速检测。方法分析近四十年来流行的风疹病毒E1基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立风疹病毒实时荧光PCR检测方法。对30例临床诊断为风疹的患者标本进行实时荧光PCR检测,并与血清学检测结果进行比对。结果 30例患者标本中实时荧光PCR检测,27份阳性,3份阴性,阳性率为90.0%,远高于血清学检测(阳性率70.0%)。结论该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为风疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。     

风疹病毒IgG抗体检测方法的研究及应用

目的:建立一个以最低保护力的抗体水平(15IU/ml)为临界值的风疹病毒特异性IgG抗体的检测方法。方法:用优选的抗原和具有变色功能的标本稀释液,用世界卫生组织提供的标准品标定标准曲线,以常规间接ELISA方法进行检测。结果:对检测方法的各个环节进行了比较研究,确定了检测方法的最佳工艺流程。对1005例育龄妇女血清标本进行检测,并与意大利Sorin公司的试剂检测结果进行比较,两种方法呈高度相关(Kappa值为0.85)。结论:本文建立的方法具有敏感、特异、简便、快速、可重复性好等特点,适用于育龄妇女风疹病毒抗体水平的筛查。     

A recombinant rubella virus E1 glycoprotein as a rubella vaccine candidate

A recombinant rubella virus E1 (rE1) glycoprotein was produced and some of its chemical and immunological features were characterized. Two animal models were then used to establish that the rE1 glycoprotein and rubella virus particles shared antigenic and immunogenic properties. In the first one, sera from rE1 glycoprotein-immunized BALB/c mice neutralized in vitro rubella virus infection. In the second model, severe combined immune deficient (SCID) mice implanted with tonsil fragments from rubella immune donors and immunized with rE1 glycoprotein produced human anti-rubella virus antibodies. Altogether, these results showed that immunization with rE1 glycoprotein elicited neutralizing anti-rubella virus antibodies. This study thus indicated that the rE1 glycoprotein could constitute a non-replicating rubella vaccine.     

辽宁省风疹野病毒基因特征分析

目的 了解辽宁省现阶段流行的风疹野病毒基因特征,为风疹的控制和消除提供科学依据。方法 用Vero/Slam细胞从2007-2008年采集的风疹暴发和散发患者标本中分离到22株风疹野病毒(Rubella Virus,RV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)针对RV分离株的E 1基因739个核苷酸片段进行PCR扩增,再对扩增产物进行核苷酸序列测定,与世界卫生组织(WHO)RV基因型参考株进行分子流行病学比较分析。结果 核苷酸和氨基酸同源性比对及构建亲缘关系树结果显示,22株RV分离株属1 E基因型,核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%～100.0%和99.1%～100.0%;与1 E基因型参考株序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%～99.1%和99.1%～100.0%结论辽宁省分离的22株RV均为1 E基因型,并且可能是辽宁省现阶段的优势基因型。     

风疹病毒山东地方株的分离与鉴定

目的 了解山东省风疹病毒流行情况，进行风疹野病毒山东地方株的分离、鉴定。方法 2001～2002年，从我省的济宁、淄博、济南、德州市风疹爆发流行中，采集53份具有风疹典型症状患者的咽拭子，经Vero，RK-13，BHK-21，MK2细胞分离培养，选出有明显的细胞病变株。结果 在Vero细胞上对HSV-1病毒攻击呈干扰现象；风疹免疫荧光阳性者；共分离出9株风疹病毒山东地方野毒株(SDRV)，代码为SDRV1、2、3、4、5、6、7、8、9。结论 细胞用于风疹病毒的分离培养，免疫荧光实验可作为风疹病毒鉴定、诊断的重要方法。     

西尼罗病毒特异性抗原片段筛选及ELISA方法的研究

目的筛选西尼罗病毒特异抗原片段,并建立其ELISA快检方法。方法参考亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性及二级结构信息,对西尼罗病毒抗原表位进行系统分析,预测得分值较高的抗原区域经原核表达、Western blot筛选及亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,对ELISA反应条件进行系统优化,建立其ELISA快检方法。结果预测获病毒特异性抗原表位29个,对其中11段进行了表达,经筛选,获得西尼罗病毒特异抗原片段及西尼罗与乙型脑炎病毒共同抗原片段各一段。利用西尼罗病毒特异抗原片段WnAg16建立了检测西尼罗病毒抗体的ELISA方法,与所试相近病毒无交叉反应,S/N比值均在23以上,对鼠抗西尼罗病毒多抗的检出下限达1∶204 800。结论利用特异性抗原初步建立了检测西尼罗病毒抗体的ELISA方法。     

狂犬病毒糖蛋白和核蛋白主要免疫活性位点的质粒载体构建

目的 为进一步研究狂犬病毒糖蛋白和核蛋白免疫活性位点的免疫特性，构建了大肠杆菌重组质粒载体。方法 参考有关献及用蛋白质亲疏水性分析程序分析狂犬病毒糖蛋白、核蛋白，以确定目的基因，用分子克隆的方法将目的基因片段插入质粒载体，最后测定重组质粒的核酸序列。结果 在大肠杆菌质粒PUC18多克隆位点EcoR I和BamH I之间，根据其阅读框架，插入了含有狂犬病毒糖蛋白主要免疫活性位点的目的基因合成片段：GⅡ免疫活性位点的第149～160位氨基酸残基及GⅢ免疫活性位点的第331～340位氨基酸残基所对应的碱基序列。在KS质粒多克隆位点EcoRI和BamH I间，插入了狂犬病毒核蛋白一免疫活性位点第374～383位氨基酸残基所对应的碱基序列。结论 为深入研究狂犬病毒免疫活性位点的免疫特性及其基因免疫打下基础。     

深圳市宝安区育龄妇女风疹病毒免疫力状况调查

目的:通过对育龄妇女风疹抗体水平的调查,了解育龄妇女对风疹病毒免疫力状况,为科学接种疫苗提供理论根据。方法:采用定量间接ELISA方法对深圳市宝安区20～40岁1291例育龄妇女进行风疹病毒免疫力检测。结果:深圳市宝安区育龄妇女风疹病毒无保护力人群占到15.88％,明显高于80年代的调查结果;另外,20～29岁年龄组、30～40岁年龄组风疹病毒无保护力人群分别为19.4％,13.5％,两组比较统计学有显著差异(P<0.05)。结论:约有1/5生育活跃期育龄妇女对风疹病毒无保护力,孕前应加强风疹疫苗注射,以减少先天性风疹综合征的发生。     

自然状态下健康人群风疹免疫水平调查

目的 :了解自然状态下风疹的流行情况 ,为风疹疫苗纳入计划免疫管理提供依据。方法 :采用半对数回归 EL ISA法对健康人群的风疹抗体水平进行检测。结果 :本次调查正常人群抗体阳性率为 70 .1%,GMT为 1∶ 6 5 .5 1,其中≥ 15岁女性抗体阳性率为 78.6 %,GMT为 1∶ 5 5 .5 1。地区间人群抗体阳性率无显著性差异 ,年龄组间 <1岁组儿童抗体水平较高。结论 :盐城市风疹自然流行率较高 ,风疹疫苗初免年龄应在 1岁以上 ,控制风疹流行的策略应该是重点保护 15岁以下儿童及育龄期妇女。     

ELISA法检测麻疹病毒IgM抗体血清外对照的设置及意义

目的为了严格控制麻疹IgM抗体ELISA检测试剂的质量,消除试剂误差产生的检测错误。方法根据麻疹IgM抗体定量测定结果,选择标准曲线线性良好部分血清标本制备外对照血清,并计算出外对照血清对于相应公司试剂的参考值范围。结果实验测得外对照血清的活性为48.2~60.5 Units/ml,对于海泰公司试剂的OD参考值范围是0.630~0.674。用此外对照血清对2个公司共5个批号的试剂盒做复核验证,发现海泰公司批号为20040806试剂盒检测结果失控,而正是此批号试剂对116份血清标本的检测阳性率和符合率明显低于其它试剂盒。还验证了此外对照血清的有效活性在4℃条件下可至少维持6个月。结论对于只有阴/阳性定性指示的ELISA检测试剂盒,制备特定OD值范围的外对照质控血清很有必要。     

Global distribution of rubella virus genotypes

Phylogenetic analysis of a collection of 103 E1 gene sequences from rubella viruses isolated from 17 countries from 1961 to 2000 confirmed the existence of at least two genotypes. Rubella genotype I (RGI) isolates, predominant in Europe, Japan, and the Western Hemisphere, segregated into discrete subgenotypes; international subgenotypes present in the 1960s and 1970s were replaced by geographically restricted subgenotypes after approximately 1980. Recently, active subgenotypes include one in the United States and Latin America, one in China, and a third that apparently originated in Asia and spread to Europe and North America, starting in 1997, indicating the recent emergence of an international subgenotype. A virus that potentially arose as a recombinant between two RGI subgenotypes was discovered. Rubella genotype II (RGII) showed greater genetic diversity than did RGI and may actually consist of multiple genotypes. RGII viruses were limited to Asia and Europe; RGI viruses were also present in most of the countries where RGII viruses were isolated.     

Persistence of rubella antibodies 15 years after subcutaneous administration of Wistar 27/3 strain live attenuated rubella virus vaccine

The rubella-specific antibody levels of children vaccinated with RA27/3 rubella vaccine have been determined over the 15 years since vaccination. Over the period monitored, titres have declined at a comparable rate to those observed in children who had experienced natural rubella infection. In both cohorts the mean rate of decay was similar throughout the 15 years of the study. One in eleven vaccinated children monitored for the entire period of the study reverted to a state of susceptibility to rubella as judged by routine rubella antibody tests used in practice today. The implications of the findings for rubella prophylaxis are discussed.