HIF-1α对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 观察缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,并探讨其可能的机制.方法 构建并筛选HIF-1 α基因的RNAi表达质粒,以脂质体LipofectamineTM 2000介导转染MCF-7细胞.转染后48h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中HIF-1α mRNA的转录水平,筛选有效的HIF-1 αRNAi质粒;CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测顺滑蛋白（SMO）mRNA表达.结果 成功构建含HIF-1α短发夹状RNA（shRNA）1～4的RNAi表达质粒,其中HIF-1 αshRNA-4干扰抑制效率为74％,干扰效果最强（P均＜0.05）.HIF-1 αshRNA-4干扰48、72、96 h后,MCF-7细胞的生长抑制率明显升高（P均＜0.05）.HIF-1αshRNA-4转染后MCF-7细胞SMO mRNA的相对表达量为0.56 ±0.06,低于转染前的1.07 ±0.16（P ＜0.05）.结论 HIF-1α表达可促进乳腺癌细胞增殖,可能与其参与调控SMO的表达有关.     

RNAi对人乳腺癌MCF-7细胞E2F1、TS基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）技术对乳腺癌细胞MCF-7中E2F1、胸苷酸合成酶（TS）基因表达的靶向抑制作用。方法设计合成并构建重组质粒pSIREN-E2F1，将重组质粒转染MCF-7细胞。筛选稳定转染的单克隆细胞扩大培养，应用RT-PCR方法检测各组细胞E2F1、TS mRNA表达情况。结果转染组E2F1、TS基因表达均受到抑制：结论RNAi技术特异、高效抑制靶基因E2F1及TS表达。     

ShRNA靶向干扰EGFR抑制结直肠癌细胞增殖的机制

目的:从细胞周期的角度探讨RNA干扰抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达对结直肠癌细胞增殖影响的机制.方法:以人结直肠癌细胞HCT-15为研究对象,构建EGFR-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,采用脂质体转染的方法转染细胞,G418筛选稳定细胞株以获得稳定的转染细胞模型,分为4组:转染shRNA-NC,转染shRNA-1组,转染shRNA-2组,转染shRNA-3组;应用半定量RT-PCR和流式细胞术检测转染细胞模型的mRNA和蛋白表达水平;应用平板克隆实验检测转染后细胞增殖能力;应用流式细胞术检测转染后细胞周期的变化.结果:正确构建了shRNA质粒表达载体,成功转染;转染shRNA-1、2、3组较转染shRNA-NC组mRNA、蛋白表达水平均有下降,以转染shRNA-1和2组的抑制效应好(40.2%±3.2%,52.8%±11.3%);转染shRNA-1、2两组较对照组增殖能力下降,G0/G1期细胞增多(63.69±2.75%,60.10±2.00%vs51.08±3.42%)、S期细胞减少(28.20%±...     

沉默LAIR-1表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭功能的影响

目的探讨白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)-1在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR方法检测乳腺癌细胞系和组织标本中LAIR-1 mRNA的表达情况。采用电穿孔转染法,将LAIR-1 siRNA转染MCF-7细胞,通过Western印迹检测LAIR-1在MCF-7细胞中的表达情况。通过四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验检测LAIR-1对MCF-7细胞增殖的影响。通过伤Boyden小室检测LAIR-1对MCF-7细胞侵袭能力的影响。结果同癌旁组织相比,乳腺癌组织中LAIR-1 mRNA的表达量显著降低(P0.01);且同非转移性乳腺癌组织相比,转移性乳腺癌组织中LAIR-1 mRNA的表达量亦显著降低(P0.01)。转染LAIR-1 siRNA可显著抑制MCF-7细胞中LAIR-1的表达。抑制LAIR-1表达后,MCF-7细胞的增殖和侵袭能力均显著升高(P0.01)。结论 LAIR-1具有抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的作用,乳腺癌组织中LAIR-1的低表达可能与乳腺癌的发生发展相关。     

siRNA逆转乳腺癌细胞MDR1及MDR3介导阿霉素耐药的研究

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)对多药耐药基因MDR1及MDR3介导的乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐阿霉素的逆转作用。方法pSuppressorNeoABCB1(针对MDR1的siRNA)及ABCB4(针对MDR3的siRNA)质粒转染MCF-7/ADR及MCF-7细胞(乳腺癌亲本细胞株),流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测MCF-7/ADR细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50),RT-PCR检测MDR1及MDR3mRNA的表达。结果转染pSup-pressorNeoABCB1的MCF-7/ADR细胞凋亡率(18.21%±1.65%)高于转染pSuppressorNeoABCB4的细胞凋亡率(9.07%±2.17%),P<0.05;二者与转染空载体组的细胞凋亡率(0.2%±0.36%)相比,P均<0.01;pSuppressorNeoABCB1质粒对阿霉素的相对逆转效应高于pSuppressorNeoABCB4质粒(P<0.05);两个质粒转染组的MDR1和MDR3mRNA表达均受到明显抑制(P均<0.01)。结论针对MDR1及MDR3基因的siR-NA可逆转乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。     

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定

目的构建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表达载体,并在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞鉴定其转染及基因沉默效果。方法应用基因工程技术,构建4条针对PETA-3基因的RNAi靶序列,分别与慢病毒载体Pg LV3连接,构建重组慢病毒表达载体PETA-3-shRNA-1~4;将连接产物转化到Top10感受态细胞,经筛选阳性克隆、测序鉴定。应用脂质体法转染293FT细胞,进行病毒包装及滴度测定。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染MCF-7细胞,实时定量PCR和Western印迹检测MCF-7细胞PETA-3 mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,感染MCF-7细胞96 h后,PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降,其中mRNA表达下降85%,蛋白表达下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/ml。结论成功构建针对PETA-3基因的慢病毒载体PETA-3-RNAi-LV3,体外感染MCF-7细胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表达。     

Bmi-1-siRNA对乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的抑制作用

目的探讨Bmi-1-siRNA对乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的作用及机制。方法将不同浓度的Bmi-1-siRNA转染MCF-7细胞,MTT法检测细胞增殖情况,免疫细胞化学技术检测转染72h后MCF-7细胞内Bmi-1、端粒酶逆转录酶（hTERT）、细胞增殖相关核抗原Ki-67蛋白的表达。结果Bmi-1-siRNA对MCF-7细胞的生长抑制率明显升高,且随浓度增高而升高（P〈0．05）;MCF-7细胞中Bmi-1、hTERT、Ki-67蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论Bmi-1-siRNA可有效抑制MCF-7细胞的增殖,其机制为降低Bmi-1 mRNA及Bmi-1、hTERT蛋白的表达。     

乳腺癌细胞中缺氧诱导因子-1α和miR-210的表达及其调控

目的探讨乳腺癌MCF-7细胞中缺氧诱导因子(HIF)-1α与microRNA-210(miR-210)的表达情况及二者之间的调控关系。方法应用Western印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分别检测MCF-7细胞中HIF-1α和miR-210的表达情况。分别构建针对HIF-1α和miR-210的shRNA质粒表达载体,利用LipofectamineTM2000转染至MCF-7细胞中,观察HIF-1α和miR-210的表达情况。结果 MCF-7细胞中存在HIF-1α和miR-210表达,转染HIF-1α的shRNA后HIF-1α和miR-210的表达明显下降;转染miR-210的shRNA后HIF-1α表达没有变化,但miR-210的表达明显下降。结论乳腺癌MCF-7细胞中存在HIF-1α和miR-210表达,HIF-1α可正向调控miR-210的表达。     

X射线对转染Smac基因重组质粒的MCF-7细胞表达及增殖和凋亡的影响

目的探讨Egr-1启动子介导Smac基因的重组质粒pshuttle-Egr1-hSmac的辐射诱导特性,以及联合X射线照射后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法将构建完全正确的pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染到人乳腺癌MCF-7细胞中,24h后给予X射线照射,24h后提取总RNA和蛋白,分别采用RT-PCR和Western印迹法检测细胞中SmacmRNA和蛋白的表达;分别采用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡的变化。结果未照射组及转染和空载体pshuttle组未见SmacmRNA和蛋白表达;而转染pshuttle-Egr-1-hSmac的MCF-7细胞在0.5Gy照射后未见其mRNA和蛋白表达;1、2和5Gy照射后明显增高,尤其以5Gy表达最高;2Gy照射后4h未见表达,而8～48h则逐渐增加,尤其以48h最高。MTT结果显示,转染了pshutlle质粒后存活率稍有降低,而凋亡未见明显变化;转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒后细胞存活率未见明显降低,而凋亡百分率稍有增加(P0.05);经过2Gy照射后各组存活率降低,凋亡百分数明显增加(P0.05,P0.01),尤其以转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒更明显。结论X射线照射联合pshuttle-Egr1-hSmac能通过提高细胞内Smac的表达,并有效抑制MCF-7细胞增殖,促进细胞凋亡,提示Smac基因联合放射治疗可能成为肿瘤治疗的新策略。     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.     

五株胰腺癌细胞株的PTCH和SMO mRNA表达

目的 研究胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3、CFPAC中PTCH和SMOmRNA表达及相关关系。方法用 RT—PCR法测定5株胰腺癌细胞株和正常胰腺组织的PTCH和SMOmRNA表达。结果 正常胰腺组织无PTCH和SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有PTCHmRNA的表达；胰腺癌细胞株PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有SMOmRNA表达，而SW1990无SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株CFPAC无PTCH及SMOmRNA表达。结论 正常胰腺组织无PTCH和SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株PTCH和SMOmRNA表达有差异，这可能与其生物学特性不同有关。     

胰腺癌组织中SMO mRNA的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织SMOmRNA的表达及其与临床肿瘤指标的关系。方法收集28例手术切除的新鲜胰腺癌及癌旁胰腺组织,利用RT-PCR方法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织SMOmRNA的表达情况。结果28例胰腺癌组织中20例胰腺癌组织有SMOmRNA表达(阳性率71.4%);28例癌旁胰腺组织中无SMOmRNA的表达;胰腺癌组织和癌旁组织SMOmRNA阳性表达率差异有显著性(P<0.01);SMOmRNA阳性表达率与肿瘤分化程度有关(P<0.05),与肿瘤的大小,淋巴结及远处转移无关(P>0.05)。结论SMOmRNA在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其表达有助于胰腺癌的诊断,并可作为判断胰腺癌恶性程度的重要指标。     

RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

目的观察RNA干扰（RNAi）对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白（Paxillin）表达的沉默作用。方法构建针对Paxillin基因序列的短发卡RNA（shRNA）表达载体,并转染至结肠癌HCT-8细胞,72 h后分别用实时定量PCR和Western blot法测定转染细胞中Paxillin mRNA及蛋白。结果根据针对Paxillin基因设计了小干扰RNA（siRNA）序列,构建了shRNA表达载体,并成功转染至HCT-8细胞。以空白对照组作均一化,转染Paxillin-shRNA_1、Paxillin-shRNA_2、Paxillin-shRNA_3、Paxillin-shRNA_NC的细胞及空白对照组细胞Paxillin mRNA相对表达量分别为0.66±0.28、0.31±0.11、1.00±0.22、1.05±0.32、1.00±0.29,Paxillin蛋白相对表达量分别为0.62±0.11、0.39±0.13、0.74±0.21、0.94±0.09、1.00±0.16。结论 RNAi可沉默结肠癌HCT-8细胞Paxillin的表达。     

Hedgehog信号通路在乳腺癌CD44^＋ CD24^-细胞中激活

目的了解Hedgehog信号通路在乳腺癌发生发展中的作用。方法采用免疫磁珠法从无血清培养的乳腺癌悬浮细胞中分选CD44＋CD24-细胞和非CD44＋CD24-细胞,分别接种于NOD/SCID鼠乳腺脂肪垫内,观察成瘤情况。采用real-time RT-PCR技术检测Hedgehog信号通路分子SMO和GLI1在CD44＋CD24-细胞和非CD44＋CD24-细胞中的表达情况。结果分选出的CD44＋CD24-细胞约占细胞总数的2.25%,SMO mRNA和GLI1 mRNA在CD44＋CD24-细胞中的表达均高于其在非CD44＋CD24-细胞中的表达（P均〈0.05）。CD44＋CD24-组乳腺癌发生率为100%（3/3）,发生肺转移、淋巴结和肺转移、肝脏和淋巴结转移各1只;非CD44＋CD24-细胞组乳腺癌发生率为50%（2/4）,未见有转移发生。结论在乳腺癌CD44＋CD24-细胞中Hedgehog信号通路分子表达增强,其与乳腺癌的浸润转移关系密切。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

生长抑素受体2转染胰腺癌细胞生物学行为的研究

目的探讨生长抑素受体2(SSTR2)对胰腺癌恶性行为的影响。方法利用原先已构建的腺病毒载体Adv-GFP-SST2R将人SSTR2全长cDNA转染导入胰腺癌细胞株PC3中,用RT-PCR检测SSTR2mRNA表达。通过肿瘤细胞与基膜成分黏附能力测定、运动能力测定、明胶酶谱法观察转染前后细胞的生物学特性的改变。结果转染Adv-GFP-SST2R的PC3细胞表达SST2RmRNA。SSTR2转染胰腺癌PC3细胞后,胰腺癌细胞与基质的黏附性、运动性下降,明胶酶的分泌能力明显减弱。结论SSTR2转染可明显减轻胰腺癌的恶性行为。