四川省2006～2007年度甲3亚型流行性感冒病毒抗原性和基因特性分析

目的 了解四川省甲3亚型流行性感冒(流感)病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的抗原性和基因变异情况,比较四川省2006～2007年度甲3亚型流感病毒流行株与世界卫生组织(WHO)推荐的2006～2007年度北半球甲3亚型流感疫苗株甲/威斯康星/67/2005(H3N2)HA1区的基因差异,为评价流感疫苗免疫效果提供依据.方法 采集四川省流感监测哨点医院和疑似流感疫情的流感样病例咽拭子,用狗肾传代细胞进行病毒分离.选取来自不同时间、地点,且经血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)试验鉴定为甲3亚型的流感病毒分离株进行单向HI试验;提取病毒核酸,进行逆转录-聚合酶链反应扩增HA基因的HA1区,对扩增产物进行序列测定并推导出氨基酸序列;将分离株的序列与甲/威斯康星/67/2005(H3N2)的HA1区序列进行比较,并进行基因进化特征分析.结果 单向HI试验表明,2006～2007年度四川省甲3亚型流感毒的抗原性与中国甲3型流感标准株(甲/云南/1145/2005和甲/江西东湖/312/2006)相比,HI效价均无≥4倍的差异.核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.59%和99.47%,仅有4～6个氨基酸位点发生了替换,涉及2个抗原决定簇.结论 四川省2006～2007年度甲3亚型流感病毒的抗原性和基因特性未发生明显变异.     

2003年广东省流感病毒的流行概况及特征

目的了解2003年广东省流感病毒的流行特点和抗原变异情况。方法根据广东地区流感监测资料进行分析；用交叉血凝抑制试验检测病毒的抗原性；用逆转录-聚合酶链反应扩增病毒HA1基因，纯化产物进行核苷酸序列测定。将序列和Genebank中相关序列进行比较，用MegAlign软件绘制种系发生树。结果全年分离到510株流感病毒，其中H3N2亚型流感481株，占92．4％；乙型流感29株，占7．6％。实验室证实流感爆发52起，其中50起暴发是由H3N2亚型流感病毒引起，2起暴发是由乙型流感病毒引起。H3N2亚型流感病毒抗原性和疫苗侏A／Panama／2007／99（H3N2）有所不同。类似干A／Fujian／411／02（H3N2）。在HAl区氨基酸序列上，和疫苗株A／Panama／2007／99（H3N2）同源性为92．1％，存在有25个氨基酸差异。28株乙型流感病毒属于Victoria系，抗原性类似疫苗侏B／HongKong／330／01，1株乙型病毒属于Yamagata系，抗原性不同干B／sichuan／379／99。结论2003年广东省流感活动比2002年要强；同时流行着甲型（H3N2）和2个谱系的乙型流感病毒，H3N2亚型毒侏是优势侏，抗原性发生了漂移。     

河北省2004～2008年乙型流行性感冒病毒监测与血凝素蛋白基因序列分析

目的了解河北省2004～2008年乙型流行性感冒（流感）病毒抗原性的变异及种系分布。方法采用狗肾传代细胞分离流感病毒,经血清学鉴定后提取病毒核糖核酸,经逆转录一聚合酶链反应扩增目的基因后,进行乙型流感病毒的血凝素重链（Heamagglutiningl HA1）基因片段的核苷酸序列测定。结果2004年10月～2008年3月,共分离到乙型流感病毒131株,其中48株为维多利亚（Victoria）系,83株为山形（Yamagata）系。2004～2005年流行期为Yamagata系毒株,2005～2006年流行期为Victoria系毒株,2006～2008年2个流行期都有Yamagata和Victoria系的毒株出现。HA2基因片段核苷酸序列测定结果显示,两个系列的毒株都有小的变异,但Yamagata系毒株变异更明显。2008年分离到的Yamagata系乙型流感病毒与2005年毒株相比已经有8个氨基酸被替代,同源性只有97．4％～98．0％。结论2004～2008年Victoria系乙型流感病毒的抗原性未发生明显的变异,但Yamagata系乙型流感病毒的基因发生变异,使抗原性发生漂移,是2007～2008年流行期引起乙型流感爆发的主要因素。     

甲3型流行性感冒病毒基因的快速检测

为建立流行性感冒(流感)的快速诊断技术,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测甲3型流感病毒的血凝素(HA)基因.对甲3型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物并进行PCR扩增,比较了它的特异性与灵敏度.结果显示该引物只能扩增甲3型流感病毒的特异性片段,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、流行性腮腺炎病毒无交叉反应.检测的灵敏度1次PCR可达10TCID50/50ml以下,2次PCR反应可达0.1TCID50/50ml以下.采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率,比采用狗肾传代细胞(MDCK)分离病毒的阳性率更高,可达到迅速、正确诊断甲3型流感的实用目的.     

贵阳市2012-2015年B型流行性感冒病毒血凝素基因特性分析

目的 了解2012-2015年贵阳市B型流行性感冒（以下简称流感）病毒的变异和流行特点,分析其与WHO推荐的疫苗株和我国的代表株匹配情况。方法 将21份标本进行血凝素基因片段1（haemagglutinin 1,HA1）基因序列测定,通过DNA Star version 7.1等软件对测序产物进行分析。结果 贵阳市B型流感病毒存在BY和BV两种谱系;核苷酸同源性显示,BV系与疫苗株B/Brisbane/60/2008的同源性为97.8%~99.3%;2013-2014年BY系与疫苗株B/Massachusetts/02/2012的同源性为96.2%~96.5%,与既往的疫苗株B/Wisconsin/01/2010同源性为99.0%~99.3%;2015年BY系与疫苗株B/PHUKET/3073/2013同源性为99.2%~99.5%;2012-2015年BV系与我国代表株B/Chongqing-Yuzhong/1384/2010同源性为96.8%~99.0%,BY系与种子疫苗株B/Hubei-Wujiagang/158/2009为98.2%~99.2%。与当年度疫苗株相比,2013-2014年BY系毒株有9个氨基酸位点发生变异,其中A134P位点涉及到抗原决定簇A区,N142K涉及到B区;2015年BY系毒株发生新的L198Q变异,且涉及到D区;BV系氨基酸位点替换多样,但很少涉及到抗原决定簇。结论 2012-2015年贵阳市人群中B型流感病毒在不断地发生改变,除2013-2014年疫苗株与流行株匹配性不佳以外,其余年度的匹配性均较好,能起到保护作用。     

浙江省近几年甲3型流行性感冒病毒株HA1基因特性分析

为了研究近几年浙江省甲3 型流行性感冒 (流感 )流行株血凝素 (HA)基因的特性 ,阐明HA基因的变异与流感流行的关系。对浙江省 1998～ 2 0 0 2年流感流行期间分离的甲3 型代表性毒株 ,提取病毒核糖核酸 (RNA) ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增病毒HA1基因 ,纯化产物进行核苷酸序列测定 ,并用DNAMAN和BioEdit软件作分析处理。结果显示 :浙江省近几年流感流行期间分离到的甲3 型流感病毒中的 8株代表毒株 ,其在HA1区域的核苷酸长度均为 987bp ,由此推导的氨基酸数为 32 9个。A/浙江 / 2 5 / 98与当时世界卫生组织 (WHO)推荐的流感疫苗株A/武汉 / 35 9/ 95株在HA1区域的核苷酸同源性为 97 4 % ,氨基酸同源性仅为 94 8% ;HA1区的抗原性已发生了一定的变异。A/浙江 / 11/ 0 2株与同期WHO推荐的流感疫苗株A/莫斯科 / 10 / 99相比 ,两者的氨基酸同源性仅为 96 1% ;且氨基酸的改变发生在抗原决定簇A区和B区的有 4个位点 ,与 1998年的流行株A/浙江 / 2 5 / 98的氨基酸同源性也只有 96 1%。说明A/浙江 / 11/ 0 2株与A/莫斯科 / 10 / 99和A/浙江 / 2 5 / 98株相比 ,其HA1区的抗原性也发生了变化 ,在基因进化树上远离A/莫斯科 / 10 / 99株和A/浙江 / 2 5 / 98株。表明由于甲3 型流感病毒HA1区域的抗原漂移导     

南宁市同期两起A（H3N2）流行性感冒疫情中流感病毒血凝素重链区基因特性

目的了解南宁市同一时期不同县区发生的两起A（H3N2）亚型流感疫情中流感病毒血凝素基因变异情况。方法从狗肾传代细胞中（MDCK）分离的A（H3N2）亚型流感病毒提取核糖核酸（RNA）,进行血凝素核苷酸全长序列测定,推导出其氨基酸序列,重点对血凝素重链区进行基因特性分析。结果两起疫情共分离到A（H3N2）亚型流感病毒5株,核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,与2007年WHO推荐的北半球疫苗株A/Wisconsin/67/2005（H3）相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.58%～98.89%和96.96%～97.87%,替换数分别为11～14个和7～10个,涉及3个重要的抗原位点。结论同期两起疫情分离到的A（H3N2）亚型流感病毒已发生抗原漂移且毒力有所改变,发生在不同县区的疫情所分离到的流感病毒性状不尽相同,同一起疫情中发病时间不同所分离出的流感病毒有一定基因差异。     

2010-2011年北京市儿童甲型H3N2流感病毒的血凝素基因特征和遗传进化分析

目的了解2010年9月1日～2011年8月31日北京市儿童甲型H3N2流感活动特点,并对病毒血凝素的基因和进化特征进行研究。方法采集哨点医院收集的1 040份儿童流感样病例样本和14份疫情样本,进行MDCK细胞分离病毒。选取26株甲型H3N2流感毒株进行血凝素(HA1)基因的扩增和序列测定。采用生物信息软件进行序列比对和进化分析。结果 2010-2011年流感监测季期间,总共分离64株甲型H3N2毒株,占分离毒株构成的65.31%。病毒HA1基因出现了Ⅰ、Ⅱ两个明显分支,均有S214I氨基酸变异。另外,分支I的毒株序列还均出现P162S、R261Q氨基酸变异;分支II的毒株序列均出现D53N、K62E、Y94H、K144N、T212A、I230V氨基酸变异,涉及A、C两个抗原决定簇,并新增1～2个糖基化位点。结论 2010年9月～2011年2月期间北京市儿童甲型H3N2流感活动活跃,并且其毒株呈现出两个明显不同的进化分支,其中一个分支毒株的血凝素基因特性发生了明显改变。     

浙江省近年H_3N_2亚型流行性感冒病毒流行株的血凝素与神经氨酸酶基因与猪型流行性感冒病毒的亲缘关系分析

目的对浙江省近年两次甲3亚型(H3N2)流行性感冒(流感)病毒流行的代表株,与猪型H3N2株流感病毒在主要抗原基因间进行比较分析,探讨二者间的亲缘关系。方法对这两次流行流感病毒代表株的血凝素(Hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因作序列测定,并与同期的人、猪流感毒株的相应基因作同源性与进化树分析。结果浙江省这两次H3N2流感流行中的代表株甲(3A3)/浙江(Zhejiang,ZJ)/10/98、A3/ZJ/6/99、A3/ZJ/8/02与猪流感病毒A3/猪型(SW)/安大略(Ontario,ON)/130/97、A3/SW/香港(Hongkong,HK)/4361/99、A3/SW/HK/74/02在HA1区的同源性,分别为99.1%、99.4%、99.4%;在NA区,A3/ZJ/10/98、A3/ZJ/6/99、A3/ZJ/8/02与猪流感病毒A3/SW/ON/130/97、A3/SW/HK/4361/99、A3/SW/HK/74/02的同源性,分别达到98.2%、99.3%、99.3%。二者之间均呈现出很高的同源性,有的远高于它与同期人流感毒株的同源性,在基...     

浙江省近几年甲3亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因分析

目的通过浙江省1998~2005年甲3亚型流行性感冒(流感)病毒的神经氨酸酶(NA)基因的序列比较,阐明近几年NA基因的变异与流感流行的关系。方法对浙江省1998~2005年流感流行期间分离的甲3亚型流感代表性毒株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因,进行核苷酸序列测定,并用Bio-Edit软件作分析处理。结果浙江省近几年流感流行期间分离到甲3亚型流感病毒代表株13株,其NA基因核苷酸长度均为1 338bp,由此推导的氨基酸数为446个。1998~2005年甲3亚型流感病毒在NA基因区发生可遗传的氨基酸变异达22个,其中1998~1999年、1999~2002年变异最大,均达到9个氨基酸的差异;2003年后病毒的变异趋向平稳,这与NA基因系统进化树的结果相一致。此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异,而在2003年后的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间的符合程度较好。结论近年来浙江省甲3亚型流感病毒的NA区域与血凝素区域相似,均发生了较大的抗原性漂移,提示1999~2005年发生的2次流感流行是由于当年的甲3亚型流感分离株变异影响到病毒的抗原性所导致的。     

2008—2009年沈阳市部分季节性流感病毒H1N1亚型HA1基因特点

目的了解沈阳市2008—2009年流行性感冒(流感)流行季节H1N1亚型的HA1基因变异特征。方法利用沈阳市流感病毒H1N1亚型分离株,采用一步RT-PCR(反转录PCR)方法扩增HA1基因,测序,推到氨基酸序列,构建种系进化树。结果 2008—2009年共采集流感样病例咽拭子样本177份,共分离到流感病毒29株,分离率为16.4%。其中H1N1亚型21株。测定了10株H1N1亚型流感病毒分离株的HA1序列,与WHO推荐疫苗株A/B risbane/59/2007比对,同源性为94.2%~97.0%,氨基酸位点99、202、208、211、230发生了突变。结论沈阳市2008—2009年流感病毒发生了一定的变异,造成了该流行季节的H1N1亚型流感病毒流行。     

东莞市2008年-2009年H1N1流感病毒血凝素HA1基因分析

目的:了解2008年-2009年东莞市H1N1流感病毒血凝素HA1基因的特征及变化。方法:采用RT-PCR、基因测序等技术得到标本HA1基因的核酸序列,利用生物信息软件对核酸及氨基酸的特征及变化情况进行分析。结果:两年间有16个氨基酸位点发生变异,6个发生在抗原决定簇,Ca区2个,Sb区4个。受体结合位点有4个变异,130环1个,190螺旋3个。潜在糖基化位点及二硫键比较稳定,2年间没有发生变化。结论:2008年-2009年两年间H1N1流感病毒血凝素HA1基因氨基酸替换速率较高。     

珠海市2008年H1N1亚型流感病毒血凝素HA1基因特征分析

目的了解2008年珠海地区流行的H1N1亚型流感病毒血凝素重链区HA1基因特征。方法按照时间不同选取7株2008年珠海市分离到的H1N1亚型流感毒株,选取的毒株进行血凝素HA1片段序列测定并推导出其氨基酸序列进行基因进化特性分析。结果H1N1亚型流感毒株为珠海市2008年的优势株,与该年WHO推荐疫苗株比较有多个氨基酸发生了替换,造成抗原性发生一定的变化。结论2008年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年珠海市H1N1亚型流感预防效果并不理想,导致2008年珠海市H1N1亚型的流行强度增加。     

Influenza A (H3N2) outbreak, Nepal

In July 2004, an outbreak of influenza A (H3N2) was detected at 3 Bhutanese refugee camps in southeastern Nepal. Hemagglutination inhibition showed that approximately 40% of the viruses from this outbreak were antigenically distinct from the A/Wyoming/3/03 vaccine strain. Four amino acid differences were observed in most of the 26 isolates compared with the A/Wyoming/3/2003 vaccine strain. All 4 substitutions are located within or adjacent to known antibody-binding sites. Several isolates showed a lysine-to-asparagine substitution at position 145 (K145N) in the hemagglutinin molecule, which may be noteworthy since position 145 is located within a glycosylation site and adjacent to an antibody-binding site. H3N2 viruses continue to drift from the vaccine strain and may remain as the dominant strains during the 2005-2006 influenza season. Thus, the 2005-2006 Northern Hemisphere vaccine strain was changed to A/California/7/2004, a virus with all 4 amino acid substitutions observed in these Nepalese isolates.     

2005年-2009年大连市季节性甲型H1N1流感病毒HA基因序列分析

目的:分析大连市2005年-2009年流感病毒H1N1亚型血凝素抗原性及其基因变异情况,为流感防治提供技术支持。方法:采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集实验测定病毒的滴度,用血凝抑制试验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT-PCR扩增血凝素HA片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析。结果:2005年-2009年共分离到季节性甲型H1N1流感病毒39株,其中28株进行了测序。与当年的疫苗株相比,2005年、2006年、2007年和2008年分离株的HA1区分别发生了11个、9个、15、15个突变。结论:在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在。该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。     

甲型H1N1病毒HA、NA氨基酸序列比较及抗原性表位预测

目的：比较新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸序列之间的差异,分析HA、NA蛋白可能的抗原性细胞表位。方法：从GenBank中选取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分离株并下载各株HA、NA的氨基酸序列;使用ClustalX和MEGA2.0软件对氨基酸序列的进行进化树分析;用Protean软件预测HA、NA蛋白的B细胞表位;用NetMHCⅡ2.2预测T细胞抗原表位。结果：世界范围的毒株之间氨基酸序列相对保守,HA及NA均只有少数位点的变异,HA蛋白氨基酸序列之间较NA蛋白氨基酸序列之间变异较大;预测HA蛋白具有8个B细胞表位和10个T细胞表位;NA蛋白有12个B细胞表位和7个T细胞表位。结论：HA、NA蛋白的少数区域抗原性相对比较稳定,可以作为检测以及疫苗研究的靶区域。     

流感病毒泰山分离株H1N1亚型血凝素HA1基因特征分析

目的分析泰安市2005—2008年流感病毒H1N1亚型的基因特征及抗原变异情况,为流感防治提供技术支持。方法采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集试验测定病毒的滴度,用血凝抑制实验和RT—PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT—PCR扩增血凝素HA1片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析。结果2005-2008年共检测咽拭子样本615份,分离出流感病毒121株,其中H1N1亚型4株。对分离的甲型H1N1毒株HA1基因进行分析,有3株病毒序列在多个氨基酸位点上发生变异,其中2007、2008年分离株和2005年分离株相比,各发生了5个和8个突变;2005、2007和2008年分离株分别与当年度的疫苗株相比,各发生了8个、11个和8个突变。和国际标准株、本年度的疫苗株A／Brisbane／59／2007（H1N1）比较,3株流感病毒共计有22个位点发生了变异。结论在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在。该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。     

甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素蛋白基因进化研究

推算全球各地近年来分离的甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒株血凝素(HA)蛋白片段的进化速率和进化分歧时间,从而初步探索流感病毒的起源和传播关系.方法搜集GenBank数据库中2008年以来登录的全球流感病毒H1序列共344条(人源性248条,猪源性84条,禽源性11条,其他1条)及本课题组分离的7条人源性H1序列,按照"分子钟"进化理论和基于markov chain monte carlo(MCMC)算法的Bayesian推断方法估算进化速率和进化分歧时间,并利用后验概率方法构建系统进化树.结果 系统进化树显示,美国人源性、猪源性与禽源性H1序列与部分亚洲猪源性H1序列构成一个主要分支(美国分支);全球其他地区的人源性H1序列构成另一个主要分支(欧亚人分支);而部分中国猪源性、禽源性H1序列与意大利分离的禽源性序列也构成一个分支(欧亚动物分支).全球H1N1和H1N2流感病毒株H1序列930 bp核苷酸序列的年平均进化速率约为2.57×10-3/位点(95%最高后验概率区间:1.96×10-33.03×10-3/位点).其中,欧洲人源性H1序列和中国大陆猪H1序列的起源时间最早,年进化速率分别为6.46×10-3/位点、0.97×10-3/位点;而美国的人源性与猪源性H1序列的起源时间相近,年进化速率则分别为5.86×10-3/位点、5.02×10-3/位点.结论 本次甲型H1N1流感暴发是北美地区H1N1病毒株长期人畜共患性积累的基因变异所致.中国大陆地区并非本次流感疫情病毒株的发源地,尚无证据能够表明北美暴发株属于一个全新的流感病毒变种.     

HA1 (Hemagglutinin) quantitation for influenza A H1N1 and H3N2 high yield reassortant vaccine candidate seed viruses by RP-UPLC

The only effective measure to decrease morbidity and mortality caused by the influenza virus in the human population is worldwide vaccination. Vaccination produces neutralizing antibodies that target the HA1 subunit of the HA (hemagglutinin) protein and are strain specific. The effectiveness of new influenza vaccines are linked to two factors, the correct prediction of the circulating strains in the population in a particular season and the concentration of the HA1 protein in the vaccine formulation. With the advent of the licensing of quadrivalent vaccines, pharmaceutical manufacturers are under considerable pressure due to time constraints and dedicated resources to deliver 194–198 million doses (2020–2021 U.S. market) of vaccine. Considering the valuable resources needed to produce the influenza vaccine in a timely manner, the efficient quantitation of the HA1 protein (the main component in the influenza vaccine) is required. Currently the only method approved by regulatory agencies for quantitation of the HA antigen in vaccines is the single radial immunodiffusion assay (SRID), an antibody dependent assay that is not time efficient. Time efficient methods that are antibody independent e.g. reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) or size exclusion-HPLC (SE-HPLC) are available. An improved method implementing reverse phase-ultra performance liquid chromatography (RP-UPLC) has been developed to quantitate the HA1 protein antigen present in the high yield reassortant vaccine seed viruses from influenza A H1N1 and H3N2 subtypes harvested from inoculated embryonated chicken eggs. This method differentiates between high yield and lower yielding reassortants in order to select the best vaccine candidate seed virus with the highest growth ‘in ovo’. This direct capability to monitor the HA1 concentration of potential reassortant seed viruses and to choose the best yielding HA influenza reassortant when faced with multiple viral seed candidates provides a major advantage on the industrial scale to the influenza vaccine process.