血管内皮生长因子基因治疗与皮瓣延迟术对大鼠腹壁轴型皮瓣成活的影响

目的 探讨血管内皮生长因子基因治疗、皮瓣延迟术两种方法及二者联合应用对大鼠腹壁轴型皮瓣成活的影响.方法 制作大鼠以右侧腹壁浅动脉为血管蒂的超范围轴型皮瓣模型,分别采用皮下注射pcDNA4-VEGF165、皮瓣延迟术及二者联合应用,按处理方法的不同分为6组,①计算各组的皮瓣成活率;②取皮瓣组织标本行常规HE染色,检测平均微血管数目及内径;③取皮瓣组织标本行VEGF免疫组化染色检测VEGF的表达情况.各试验组与空白组相对比,各试验组之间两两对比.结果 各试验组的皮瓣成活率明显高于空白组,延迟同时基因治疗组的皮瓣成活率明显高于其他试验组;基因治疗组及联合应用组的平均微血管数目明壶高于延迟组及空白组;平均微血管内径:延迟组＞联合应用组＞基因治疗组＞空白组;免疫组化染色显示基因治疗组及联合应用组VEGF表达明显高于空白组及单纯延迟组.结论 皮下注射pcDNA4-VEGF165和皮瓣延迟均能有效地改善大鼠皮瓣的成活,但其作用机制不同,而二者的联合应用则能进一步地提高大鼠皮瓣的成活率.     

血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子促进预构皮瓣血管新生作用的比较

目的 比较血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在促进预构皮瓣血管新生作用上的差异,探讨EPCs移植提高预构皮瓣存活面积的可行性.方法 分离雄性Wistar大鼠(45只)一侧股血管柬,转位植入腹部皮下,建立预构皮瓣实验模型.将体外诱导分化的EPCs(组Ⅰ,n=15)和VEGF(组Ⅱ,n=15)分别注射于皮瓣局部,对照组仅注射PBS溶液(组Ⅲ,n=15).4周后形成以植入血管为蒂的岛状皮瓣,原位缝合;术后7 d对皮瓣存活率、血管密度计数进行检测.结果 组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ的皮瓣存活率分别为(87.26±10.13)%、(66.13±9.9)%、(55.59±13.06)%,组Ⅰ分别与组Ⅱ和组Ⅲ比较,差异均有统计学意义(P<0.001);微血管密度分别为:(38.67±9.52)个/mm~2、(25.83±6.33)个/mm~2、(26.5±5.61)个/mm~2(P<0.05).结论 EPCs促进预构皮瓣血管新生的作用优于VEGF,局部应用骨髓来源的EPCs可以有效地提高预构皮瓣存活面积.     

血管内皮生长因子基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗对大鼠缺血皮瓣生存的影响。方法建立大鼠缺血皮瓣的动物模型 ,采用直接注射法转移 pcD2 /hVEGF12 1真核表达质粒于大鼠缺血皮瓣肉膜层 ,术后 7d ,应用苏木素 伊红 (HE)染色、单光子发射计算机断层摄影 (SPECT)及计算机图像分析软件等方法检测皮下血管密度、皮瓣血供和皮瓣成活率。结果　经VEGF基因治疗组的大鼠缺血皮瓣与对照组相比较具有皮下血管密度增加、血液供应增多和皮瓣成活率显著性增高 (P <0 .0 1)。结论　VEGF基因治疗能够诱导新血管形成、增加血流灌注 ,促进缺血皮瓣的生存。     

电脉冲介导的血管内皮细胞生长因子基因治疗对大鼠随意型皮瓣成活的影响

目的探讨血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)质粒直接皮下注射,结合直流电脉冲刺激的基因治疗方案的血管生成效应及不同剂量质粒对皮瓣成活的影响。方法设计大鼠随意皮瓣模型,利用直流电脉冲将皮下注射的重组质粒PCMVMCSVEGFIRES2EGFP导入缺血皮瓣内。观察皮瓣成活的情况,利用苏木素伊红(HE)染色,观察VEGF基因的血管生成效应。结果皮下直接注射结合直流电脉冲成功地将重组质粒导入皮肤。基因转染后7d观察到明显的血管增生。基因治疗组皮瓣成活面积[80μg为(77.38±4.56)%,400μg为(82.57±5.21)%]显著大于对照组[(48.96±4.32)%]。但两基因治疗组皮瓣成活面积差异无统计学意义。结论VEGF质粒直接皮下注射结合直流电脉冲刺激能够高效转染大鼠皮肤,具有明显的血管生成效应,能够显著促进大鼠随意型皮瓣的成活。质粒的剂量对皮瓣成活的影响差异无统计学意义。     

pcDNA3.1(+)载体携带血管内皮生长因子治疗大鼠缺血皮瓣

目的 观察注射真核表达载体pcDNA3.1(+)携带血管内皮生长因子(VEGF)基因后对大鼠缺血皮瓣存活的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3.1(+)-VEGF,将SD大鼠随机分成3组,每组10只.pcDNA3.1(+)-VEGF组:于背部皮肤皮下多点注射pcDNA3.1(+)-VEGF 30 μg/100μl;VEGF组:多点注射VEGF蛋白100 ng/100μl;生理盐水(NS)组:注射生理盐水100μl,注射2d后在其背部形成7 cm×3 cm的全厚随意型皮瓣,48 h后按原设计掀起皮瓣并原位缝合.术后10 d测量皮瓣的成活面积,计算成活面积百分比,并行免疫组织化学检测.结果 皮瓣成活面积百分比:pcDNA3.1(+)-VEGF组为(79.1±3.5)％,VEGF组为(62.2±2.7)％,NS组为(59.9±3.1)％,pcDNA3.1(+)-VEGF组皮瓣成活面积明显高于其他两组(P＜0.05).结论 皮下注射pcDNA3.1(+ )-VEGF可促进新生血管的形成,比单纯注射VEGF蛋白更能提高皮瓣的成活率.     

血管内皮生长因子基因治疗联合外科延迟法改善大鼠腹壁超范围轴型皮瓣成活的研究

目的探讨皮下注射血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因、外科延迟两种方法及其联合应用对大鼠腹壁超范围轴型皮瓣成活的影响。方法取雄性Wistar大鼠48只,体重400～450g,制作大鼠以腹壁浅动脉为血管蒂的8cm×8cm超范围轴型皮瓣模型。随机分为六组,每组8只,分别为空白对照组（A组）、术时基因治疗组（B组）、术前基因治疗组（C组）、单纯延迟组（D组）、延迟同时基因治疗组（E组）和延迟后基因治疗组（F组）。术后7d,计算各组的皮瓣成活率;取皮瓣组织标本行HE染色,检测平均微血管密度及内径;取皮瓣组织标本行VEGF免疫组织化学染色检测VEGF165的表达。结果各实验组皮瓣成活率均显著高于A组（P〈0.05）;实验组中,E组皮瓣成活率显著高于其他各组（P〈0.05）,余各实验组间差异无统计学意义（P〉0.05）。微血管密度：B、C、E、F组显著高于A、D组,差异有统计学意义（P〈0.05）;B、C、E、F组间以及A、D组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。微血管内径：D组显著大于E、F组,差异有统计学意义（P〈0.05）;而D组和E、F组均显著大于A、B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）。免疫组织化学染色示A组及D组有少量VEGF165沉积,染色深度明显浅于其他各组。B、C组和E、F组可见毛细血管内皮细胞胞浆内有棕褐色VEGF165抗原抗体复合物的沉积,染色较深,部分沉积物呈带状围绕血管腔。各组实验动物角膜层均未见新生血管。结论皮下注射pcDNA4-VEGF165和外科延迟均能有效改善大鼠皮瓣的成活,但二者作用机制不同,而延迟的同时皮下注射VEGF基因能进一步提高大鼠皮瓣成活率。     

血管内皮生长因子基因改善大鼠腹壁下动脉皮瓣成活的实验研究

目的　通过血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因对腹壁下动脉皮瓣的转染 ,探讨应用VEGF基因对皮瓣成活的影响。方法　以SD大鼠为实验模型制作腹壁下动脉皮瓣 ,并分别注入脂质体包裹的PCD VEGF1 6 5(目的基因组 ) ,PCD(空白质粒组 )和生理盐水 (生理盐水组 )。术后 ,①通过腹腔注射荧光素钠估计皮瓣的血流量 ;②计算断蒂后各组大鼠皮瓣的成活面积 ;③取大鼠皮肤标本行常规染色检测平均血管数目及内径 ;④皮肤标本行VEGF免疫组化染色检测VEGF表达情况。结果　目的基因组、空白质粒组和生理盐水组的平均荧光染色面积分别为6 0 6 4%、30 15 %、2 9 89%(P <0 0 5 ) ,大鼠断蒂后的平均成活面积分别为 92 3%、30 5 %、31 8%(P<0 0 5 ) ,平均血管数目分别为 10 1 72、91 35、89 85 (P <0 0 5 ) ,平均血管内径分别为 2 6、31 0 9、32 5 1μm(P <0 0 5 ) ,免疫组化染色示目的基因组染色深度明显高于空白质粒组和生理盐水组 (P <0 0 5 )。结论　PCD VEGF1 6 5转染能够改善皮瓣的成活 ,且通过转染表达了丰富的VEGF1 6 5。     

皮下注射血管内皮生长因子基因提高大鼠背部随意皮瓣活力的实验研究

目的 探索基因治疗在组织移植方面的方法。应用 构建并体外扩增表达质粒pcDNA3.1/Zeo( )-VEGF165，以之直接皮下注射转染SD大鼠背部随意皮瓣模型。通过与对照组相比较，观察其对皮瓣活力的影响，并采集组织行免疫组化检查。结果 基因转染组在毛细血管周围及肌间隙可见VEGF的沉积，与对照组相比皮瓣的平均成活面积显著增加。结论 皮下注射的基因在组织中能够表达VEGF，增加皮瓣活力，是一种简单有效的基因治疗方法。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子小干扰RNA对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹状小分子干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤细胞株MG63增殖和凋亡的影响.方法 将携带VEGF短发夹状siRNA的腺病毒载体Ad-VEGF-siRNA感染MG63.噻唑蓝(MTT)比色分析细胞体外增殖力,Hoechst染色、流式细胞术观察细胞凋亡.建立30只裸鼠移植瘤模型,Ad-VEGF-siRNA组瘤内注射Ad-VEGF-siRNA病毒纯化液0.2ml,通过免疫组织化学技术,观察肿瘤组织中MG63细胞的增殖和凋亡.结果 与对照组比较,Ad-VEGF-siRNA组MG63细胞生长减慢,Hoechst染色可见到典型的凋亡细胞,24、48、72h凋亡率分别为7.27%、12.01%和20.09%.Ad-VEGF-siRNA明显抑制移植瘤生长,抑瘤率达40.7%.Tunel染色可见MG63细胞典型凋亡特征,同时肿瘤组织中PCNA、bcl-2表达明显减少(P<0.01). 结论 Ad-VEGF-siRNA可高效而特异地阻断VEGF基因表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡.     

脂质体介导血管内皮生长因子基因促进大鼠皮瓣早期断蒂的观察

1材料与方法 1.1 重组质粒的制备 pcDNA血管内皮生长因子(VEGF)165(华中科技大学同济医学院杨操博士提供)含VEGF165基因片段,位于BamH I和EcoR I 2个酶切位点之间.将其转入大肠杆菌HB101感受态细胞,挑选抗氨苄西林克隆进行小量快速提取,用BamH I和EcoR I双酶切鉴定.同时送北京华大生物公司测序.将保存的大肠杆菌菌种通过碱裂解法提取大量质粒后进一步纯化.质粒经核酸蛋白微量仪(Smart SPECTM型,美国 Bio-Rad公司)检测,定量为12.5μg/μL,以等渗盐水稀释至1μg/μL备用.     

pcD2/hVEGF对缺血皮瓣存活的影响

目的 观察并探讨pcD2/hVEGF对缺血皮瓣血循环重建和皮瓣存活率的影响.方法 SD大鼠24只,分2组,每组12只.在鼠背部制作蒂位于尾侧的缺血皮瓣(7cm×1cm).实验组皮下注射pcD2/hVEGF,对照组皮下注射生理盐水,术后7天观察皮瓣存活面积比、单位面积微血管计数和及VEGF基因表达水平.结果 2组中pcD2VEGF组皮瓣存活面积比、单位面积微血管密度与对照组有显著性差异.结论 pcD2VEGF能促进缺血皮瓣存活.     

人血管内皮生长因子-C基因治疗淋巴水肿的实验研究

目的 观察人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因治疗阻塞性淋巴水肿的疗效.方法 成年新西兰大白兔制成右后肢淋巴水肿模型;SD大鼠制成尾巴淋巴水肿模型.每种动物随机分2组,治疗组皮内注射人VEGF-C基因,对照组皮内注射生理盐水.测量治疗前后水肿部位体积变化;第3周取材,测VEGF-C mRNA及蛋白的表达水平;用淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)抗体免疫组化染色观察淋巴管增生情况.结果 基因治疗后兔右后肢体积明显减少,其减少值分别为:治疗组(24.40±1.08)ml,对照组(5.80±1.92)ml,差异有统计学意义(P=0.0001);治疗组VEGF-C mRNA及蛋白明显表达,而对照组则不明显;治疗组淋巴管数量显著多于对照组(P=0.0004),且管腔较粗.结论 用VEGF-C基因治疗可诱导淋巴管生成,减轻或消除淋巴水肿.     

血管内皮生长因子反义核酸对肝癌生长的抑制作用

目的　探讨血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）在实体肿瘤中的作用。方法　应用分子克隆技术构建人全长ＶＥＧＦｃＤＮＡ反义基因真核表达载体,并用脂质体法转入人肝癌细胞系（ＨｅｐＧ２） ,观察转染后肝癌细胞在裸鼠体内的生长及瘤体内微血管的通透性。结果　各组细胞在裸鼠体内的成瘤时间无明显差别,但反义核酸转染组肿瘤的生长速度及瘤体的重量均明显落后于其他组,肿瘤内血管的通透性也显著降低。结论　ＶＥＧＦ在实体肿瘤的生长过程中起着十分重要的作用。     

血管内皮生长因子-碱性成纤维细胞生长因子基因治疗家兔肢体缺血的研究

目的　了解血管内皮生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)联合克隆基因 (VEGF bFGF)治疗兔下肢动脉缺血模型后新生血管和侧支形成状况。方法　应用 40只家兔制成下肢缺血模型 ,其中VEGF bFGF组 10只 ,VEGF组 12只 ,空载体组 8只 ,生理盐水 (NS)组 10只。构建pcDNA3 /VEGF和pcDNA3 /VEGF bFGF真核表达载体。转染缺血部位肌组织 ,行下肢血管造影。结果　血管造影计数显示 ,VEGF bFGF组在转染后 14d(1.98± 0 .2 2 ) ,2 8d (1.81± 0 .5 2 ) ,5 6d(2 .2 1± 0 .44 )和 3个月 (2 .10± 0 .2 2 ) ;VEGF组在 2 8d(1.3 8± 0 .2 9) ,5 6d(1.94± 0 .2 5 )和 3个月 (2 .2 4± 0 .3 1) ,新生血管形成较对照组显著增加 (P <0 .0 5 )。结论　VEGF bFGF真核表达载体可以获得局部高效表达 ,刺激新生血管生成 ,建立侧枝循环 ,改善肢体缺血。     

Effect of adenovirus-mediated gene transfection of vascular endothelial growth factor on survival of random flaps in rats

Objective: To evaluate the effect of local application of vascular endothelial growth factor ( VEGF ) via adenovirus-mediated gene transfer on survival of full thickness flaps selected randomly in rats.Methods: Thirty Sprague-Dawley rats weighing 480-520 g were used in this study. A dorsal flap (8 cm × 2 cm) in full thickness with the pedicle located at the level of the iliac crest was designed. Then the rats received 1 012 pfu replication-deficient recombinant adenovirus carrying VEGF ( AdCMV-VEGF group, n = 10 ), 1012 pfu recombinant β-galactosidase adenovirus ( AdCMV-Gal group, n = 10) and 1 ml saline (saline group, n = 10), respectively, in the distal two thirds of the proposed flap by means of subdermal injection at 8 different locations. Three days after treatment, the flaps were elevated as originally designed and sutured back in situ. The survival rate of the flaps was evaluated on day 7 after operation.Results: The survival rate of the flaps in the AdCMV-VEGF group increased significantly as     

血管内皮生长因子基因在原代培养大鼠肝细胞的转染表达

目的　研究血管内皮生长因子基因 (VEGF12 1)在原代培养大鼠肝细胞中转染表达。方法　构建 pIRES EYFP /VEGF12 1质粒 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、WesternBlot和荧光显微镜观察VEGF基因在原代培养大鼠肝细胞中的转染表达。结果　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建并转染原代培养大鼠肝细胞 ,RT PCR观察到 2 5 8bp的VEGF特异性条带 ,WesternBlot检测到相对分子质量 42× 10 3 的特异性条带 ,荧光显微镜观察到转染阳性肝细胞发出黄绿色荧光。结论　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒在原代培养大鼠肝细胞转染并表达 ,为VEGF基因修饰肝细胞移植和基因治疗奠定基础。     

血管内皮生长因子反义RNA对EC9706人食管癌细胞抑制的作用

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对EC9706人食管癌细胞的抑制作用.方法 用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染至EC9706人食管癌细胞,用噻唑蓝还原法(MTT法)检测EC9706细胞增殖,免疫组化SABC和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测VEGF蛋白和VEGF mRNA表达水平.流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布.并将转基因EC9706细胞接种于BALB/C裸鼠后肢皮下,4周后观察皮下成瘤情况.结果 被反义VEGFcDNA质粒转染的EC9706食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞VEGF mRNA及蛋白的表达水平降低,但细胞生长增殖能力和增殖周期无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠28 d后,EC9706-wt组、EC9706-A组及EC9706-E组皮下移植瘤的潜伏期分别为(5.8±2.4)、(12.4±3.6)、(5.3±2.2)d,瘤体重量分别为(2.83 ±0.32)、(0.87±0.14)、(2.62 ±0.68)g,EC9706-A组与其他两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 VEGF反义RNA可抑制EC9706食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内肿瘤生长.     

血管内皮生长基因定向转染防止急性血管桥狭窄的研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因疗法对血管吻合口急性狭窄的预防作用。方法切断兔颈总动脉,进行原位端端吻合,向吻合口血管腔内注入真核表达质粒pcDNA_3／VEGF_(165)(治疗组)和真核载体pcDNA_3溶液(对照组),使之在腔内滞留30 min,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印记法检测吻合口组织的VEGF_(165)基因和其蛋白的表达,同时进行吻合口病理形态学检测和同位素Cr-51标记的血小板计数。结果实验组与对照组术后1周V EGF_(165) RNA和其蛋白表达分别为0．326±0．095,0．137±0．033和0．517±0．140,0．248±0．062差异有统计学意义。治疗组吻合口周围同位素Cr-51标记的血小板数目和吻合口血栓出现率均明显少于对照组。结论将外源性VEGF_(165)基因转入吻合口血管壁中可减少吻合口血小板沉积和黏附,有效地防止术后血管急性狭窄。