小鼠TGFBI基因真核表达载体的构建和表达

目的构建小鼠TGFBI基因的真核表达载体,为研究角膜营养不良的发病机制奠定基础。方法提取BALB/cBy小鼠正常角膜组织总RNA,经反转录-PCR合成TGFBI cDNA,克隆入真核表达载体pcDNA3.1并测序验证。用不同剂量重组质粒pcDNA3.1-TGFBI转染NIH3T3细胞,通过SYBR荧光实时定量PCR和Western blot检测TGFBI在细胞中的表达。结果测序结果显示扩增到的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,实时定量PCR和Western blot结果显示TGFBI在NIH3T3细胞中表达增强。结论成功构建了小鼠TGFBI基因真核表达载体,并在细胞中进行表达,为进一步研究TGFBI在角膜内的生理、病理功能奠定基础。     

pEGFP-N1-Endostatin重组质粒的构建及其体外表达

目的构建分泌型人内皮抑素（ES）的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Westernblot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达。结果通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确。采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20 000的人ES蛋白表达。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白。     

Cx50 V64G突变的生物信息学分析及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达载体,用生物信息学软件分析V64G突变对人缝隙连接蛋白Cx50的影响。方法:经PCR获得Cx50基因片段,重组至真核表达载体pcDNA3.1/Amp( )中,经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了具有V64G突变的Cx50的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。并证明64位缬氨酸在不同物种的Cx50及在人的多种缝隙连接蛋白是高度保守的区域,与白内障的发生高度相关。结论:pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达质粒的成功构建和鉴定为进一步研究白内障机理奠定了基础。     

小鼠B、T淋巴细胞衰减因子真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建小鼠B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）的真核表达载体,并分析其在人胚肾HEK293细胞中的表达,为单纯疱疹性角膜基质炎的免疫治疗奠定基础。方法应用PCR法获得小鼠BTLA胞外功能区的cDNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得重组表达质粒pBTLA,经酶切鉴定和测序正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光法、实时定量PCR（real-time PCR）、Western blot技术检测BTLA在细胞中的表达。结果重组质粒pBTLA经酶切鉴定和测序,确认插入序列正确,与基因文库中提供的基因序列同源性达98%～100%。Real-time PCR检测可见转染了重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA mRNA表达增强（P=0.00）,3个组间HEK293细胞内BTLA mRNA表达差异有统计学意义（F=167.83,P=0.00）;Western blot结果显示,转染重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA蛋白表达明显增强,转染后24～48 h表达最强。间接免疫荧光结果显示BTLA蛋白主要表达在HEK293细胞的细胞膜和细胞质中。结论成功构建了BTLA的真核表达载体,该重组质粒在HEK293细胞中能够表达BTLA,为后续研究BTLA在抗病毒免疫中的作用奠定基础。     

FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用

目的 探讨转录因子FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用.方法 建立角膜移植动物模型.将57只SD大鼠随机分为A组(正常组)、B组和C组(术后0、2、 4、 6、8 d分别球结膜下注射生理盐水和地塞米松注射液).用裂隙灯观察移植排斥情况,RT-PCR检测植片内FOXP3 mRNA的表达,流式细胞术检测移植术前和术后不同时间外周血CD4 CD25 T及CD4 FOXP3 T淋巴细胞的表达.对各组角膜植片进行CD4、CD8、CD25和FOXP3表达的免疫组织化学检测.结果 C组发生排斥反应时间较B组明显延迟(P<0.05),B组术后第11 d角膜植片内FOXP3 mRNA的表达较C组明显减弱(P<0.05),对照组CD4 CD25 T/CD4 T的表达明显高于术前(P<0.05),而CD4 FOXP3 T/CD4 T的表达明显低于术前(P<0.05),植片中CD4、CD8和CD25表达明显,FOXP3有一定的表达.角膜移植排斥反应期间,地塞米松治疗组FOXP3和CD4 FOXP3 T/CD4 T的表达明显增强,CD4 CD25 T/CD4 T的表达明显减弱.结论 FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用;增强植片内FOXP3的表达或增加外周血CD4 CD25 Tr淋巴细胞的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生.     

人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区,将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中,进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中.经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.结果:获得了人TGFBI的编码基因,并成功建了其真核表达载体.结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定.     

大鼠β-防御素2真核表达载体构建及转染大鼠角膜上皮细胞的研究

目的：应用基因工程技术构建含大鼠β-防御素2(rat beta defensin 2,rBD-2)目的基因的真核重组质粒,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,检测目的基因在转染细胞中的表达,探讨应用该载体获得重组rBD-2在眼表细胞中表达的可行性,并为进一步研究rBD-2的体内外抗微生物活性提供实验基础,以期为感染性角膜病防治提供新方法。

方法：将采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成rBD-2 DNA片段连接到真核表达载体pIRES2-ZsGreen1的XhoⅠ与BamHⅠ酶切位点之间,构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,卡那霉素筛选出阳性克隆子,经酶切、测序鉴定重组载体构建成功后,采用脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,此处实验分为三组即重组载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染的大鼠角膜上皮细胞组、未转染的空细胞组以及空载体pIRES2-ZsGreen1所转染的大鼠角膜上皮细胞组,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,最后经实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测各组转染细胞中rBD-2基因mRNA的表达差异。

结果：成功构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组质粒,应用实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测到重组质粒pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染组的大鼠角膜上皮细胞中rBD-2基因的mRNA表达水平明显多于另两组。

结论：应用基因工程技术构建的rBD-2真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,能够使外源rBD-2基因在大鼠角膜上皮细胞中被转录成mRNA。     

小鼠野生型和截短型睫状神经营养因子基因的克隆及真核表达

目的构建野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因的真核表达载体,并在ARPE-19细胞系表达目的蛋白。方法通过逆转录聚和酶链反应(RT-PCR)扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列,体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA编码序列,将上述两序列分别克隆至pTracer-CMV真核表达载体,转染ARPE-19细胞,免疫印迹检测2种CNTF的表达。结果PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因,DNA序列分析证实2种真核表达载体中的CNTF序列与Gene Bank中目的序列一致。2种重组真核表达质粒转染ARPE-19细胞后,免疫印迹证实CNTF在ARPE-19细胞培养上清中有表达。结论野生型和截短型CNTF基因在ARPE-19细胞系的真核表达为视网膜色素变性基因治疗研究奠定了基础。     

大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建

目的克隆大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)基因并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF,用于视神经损伤修复的基因治疗。方法利用RT-PCR的方法从大鼠海马组织的总RNA中扩增BDNF基因片段,序列两端分别引入限制性内切酶识别位点EcoR I和Xho I,并将其定向克隆入pMD18-T Si mple载体,测序正确后亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN。结果经过PCR、酶切和测序鉴定,所克隆的BDNF基因序列正确,克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。结论成功克隆了BDNF基因并且构建了真核表达载体pLXSN-BDNF,为进一步研究基因治疗视神经损伤疾病奠定基础。     

Treatment of retinal detachment of the course of retinopathy of prematurity

Cryo- and laser therapy of stage 3 have reduced, but not eliminated the occurrence of retinal detachment in stages 4a, 4b and 5 of ROP. In this disease the treatment of these stages is still the greatest challenge to the ophthalmologist. Therefore, the aim of this paper is to present our up-to-date possibilities of treatment of different kinds of retinal detachments in ROP, including segmental scleral buckling, encircling scleral buckling, scleral resection, vitrectomy and its modifications in ROP. Guidelines of surgery of retinal detachment in active stage 4 and 5 of retinopathy of prematurity have been described.     

Analysis of some of the possible neonatal risk factors of development of retinopathy of prematurity

PURPOSE: The aim of the study was to evaluate some of the possible risk factors for retinopathy of prematurity (ROP) treated with laser photocoagulation or cryocoagulation. MATERIAL AND METHODS: The study comprised 71 preterm infants with ROP needing treatment and 118 prematures without ROP or with ROP requiring no treatment, as a control group. All infants were born with gestational age < or = 32 weeks and birth weight < or = 1500g. The perinatal variables, including some of clinical data, the length of mechanical ventilation as well as continous positive airway pressure (CPAP), duration of total parenteral nutrition and some of laboratory data were analyzed, to evaluate their correlation with the development of ROP. RESULTS: Gestational age before 28 weeks (OR = 5.11), episodes of convulsiones (OR = 2.15), mechanical ventilation for more than 20 days (OR = 5.86) and > 30 days (OR = 7.47), CPAP for more than 5 days (OR = 4.15) and > 10 days (OR = 2.84), total parenteral nutrition for more than 10 days (OR = 7.84) and > 20 days (OR = 9.02) and elevated peak of alanine aminotransferase (AIAT) levels (OR = 3.17) were significant risk factors for ROP requiring treatment. CONCLUSIONS: The opthalmic examination for retinopathy of prematurity requiring laser photocoagulation or cryocoagulation should be obligatory for prematures born < or = 32 weeks of gestational age, with birth weight < or = 1500 g.The frequency of the consecutive ophthalmic examinations depends on the severity of prematurity and on the presence and intensification of the risk factors for ROP.     

角膜曲率的分析

目的：探讨我国人角膜曲率半径的正常值及不同性别、不同年龄的角膜曲率半径差异。方法：对10998只眼的角膜曲率进行检测，并按男、女10岁一组进行统计分析。结果：（1）K1为7.65mm,K2为7.71mm，平均K值为7.67mm。较眼科学正常值K:7.77mm短0.1mm。（2）K的平均值男性较女性的长0.1155mm。且女性各年龄段角膜曲率半径均男性的有不同程度的减短。（3）男女均随年龄的增长，角膜曲率半径大致呈递减趋势，即：角膜曲率半径与年龄成反比关系。（４）男女K1,K2之比，均随年龄增长而增长，即K1逐渐增长而增长，即　K1值逐渐增长，K2逐渐减短。结论：本文测定的角膜曲率较眼科文献中的提供的正常值短0.1mm，并且存在着年龄、性别上的差异。     

艾滋病眼部并发症的资料分析

目的:通过调查分析,了解艾滋病眼部并发症的临床表现、治疗及预后。方法:收集赞比亚卡布韦总医院眼科2008-08/2009-08就诊患者。结果:艾滋病眼部并发症症状重,病程长,致盲率高。结论:充分认识、掌握艾滋病眼部并发症的临床表现,提高艾滋病的检出率,早发现、早治疗,提高艾滋病患者的生活质量。同时应强调预防是降低艾滋病发生率的关键。