体外研究人细胞色素P450 3A4等位基因多态性对药物代谢和药物相互作用的影响

 目的 体外研究药物对人细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）（野生型，WT）及其 4 个突变等位基因重组酶 CYP3A4*3（M445T）、CYP3A4*4（I118V）、CYP3A4*17（F189S）和CYP3A4*18（L293P）的抑制程度。 方法 采用荧光高通量法和 HPLC 法分别测定 WT 及其 4 个突变等位基因重组酶催化荧光底物——二甲基荧光素（DBF）脱烷基化和探针底物——硝苯地平氧化反应时的酶动力学参数；且通过测定大扶康、万络、西乐葆、酮康唑、地尔硫卓和维拉帕米的半数抑制浓度（IC50）值，确定6 种药物对酶的抑制程度。 结果 除 F189S 外，其余 4 种重组酶均能催化DBF 和硝苯地平反应生成相应的产物。各突变等位基因重组酶催化 DBF 反应的 Km 值（亲和力）与 WT 相当，M445T 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 3.1 和 3.8 倍（P < 0.05），I118V 是 WT 的 1.3 倍（P = 0.1010）。各重组酶催化硝苯地平氧化反应的 Km 值均比 WT 小，I118V 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 0.7 和 2.6 倍（P < 0.05），M445T 与 WT 相当（P = 0.7676）。6 种药物对各重组酶的抑制程度强弱均为：酮康唑 > 地尔硫卓 > 维拉帕米 > 大扶康 > 西乐葆 > 万络；药物对各重组酶的 IC50 值大小为：WT < L293P < M445T < I118V。 结论 等位基因突变导致了酶动力学特征的改变和药物对酶抑制程度的不同，为进一步研究临床联合用药安全性奠定基础。     

体外重组人细胞色素P450 2C9 酿酒酵母表达体系的构建及其基因多态性对药物相互作用影响的初探

 目的 体外构建重组人细胞色素 P450 2C9（CYP2C9）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达体系,且利用该体系研究药物对 CYP2C9 基因多态性酶抑制程度的差异性。 方法 将 CYP2C9*1（野生型）和通过定点突变 PCR 法获得的等位基因突变克隆 CYP2C9*2（R144C 突变体）和 CYP2C9*3（I359L 突变体）电穿孔转化酿酒酵母后,差速离心法制备酿酒酵母微粒体,蛋白免疫印迹法检测 3 种 CYP2C9 微粒体蛋白的表达;HPLC 法检测 CYP2C9*1 与特异性底物双氯芬酸的反应,记录产物峰面积值,利用 PrismDemo 软件计算米氏常数（Km）值;利用荧光底物 BOMCC 对 3 个等位基因进行酶活性分析,分别计算 Km、最大酶促反应速度（Vmax）和内在清除率。采用荧光高通量方法测定 5 种药物（甲苯磺丁脲、磺胺苯比唑、酮康唑、氟西汀和泰洛平）对酶的抑制程度。 结果 蛋白免疫印迹结果表明,3 个等位基因均表达目的蛋白。CYP2C9*1 代谢双氯芬酸的 Km 值为 5.34 ± 0.96 μmol/L;以 BOMCC 为底物时,CYP2C9*1 和 CYP2C9*2 的 Km 值分别为 16.94 ± 4.78、34.73 ± 5.51 μmol/L,Vmax 分别为 0.21 ± 0.10、0.12 ± 0.01 pmol/（min&;#8226;pmol P450）,内在清除率分别为 0.012 ± 0.003、0.003 ± 0.0001 µl/（min&;#8226;pmol P450）;CYP2C9*3 无催化活性。5 种药物对 CYP2C9*1 的抑制程度：磺胺苯比唑 > 酮康唑 > 氟西汀 > 甲苯磺丁脲 > 泰洛平;对 CYP2C9*2 的抑制程度：磺胺苯比唑 > 甲苯磺丁脲 > 酮康唑 > 氟西汀 > 泰洛平。 结论 成功构建了重组人细胞色素 CYP2C9 及其多态性等位基因（CYP2C9*2、CYP2C9*3）酿酒酵母表达系统;初步建立了药物对 CYP2C9 基因多态性酶的抑制作用体外检测体系,为指导临床联合用药奠定了基础。     

重组日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）酶学特性的研究

目的获得重组SjLDH主要的酶动力学参数。方法分光光度计测定NADH在340nm处吸光度的变化，检测不同pH及温度下重组蛋白催化正、逆反应的效率以确定其最佳pH、最佳温度；分别固定底物NADH、丙酮酸、NAD＋及乳酸浓度，分别测定丙酮酸、NADH、乳酸及NAD^＋在不同浓度下的反应速度，计算机Lineweaver-Burk双倒数方程回归计算各底物的米氏常数（Km值）、最大反应速度（Vmax）。并比较各自的Vmax／Km值。结果重组蛋白酶活性为379U／mg。催化正、逆反应的最佳pH分别为pH6．0—7．0和pH9．0—10．0；催化正、逆反应的最佳温度分别为37—60℃及40—50℃，后者在70℃时仍有较高催化活性；在NADH辅酶作用下，重组SjLDH催化丙酮酸还原为乳酸的最大反应速度是催化NAD＋作用下乳酸氧化为丙酮酸的21倍。比较丙酮酸与乳酸的Vmax／Km值。前者是后者的23倍。而NADH的Vmax／Km值是NAD＋的7倍。结论重组蛋白在生理条件下主要催化丙酮酸还原为乳酸的反应。     

A2M基因多态性与帕金森病和特发性震颤的关联

目的探讨α2-巨球蛋白基因（α2-macmglobulin gene，A2M）第24外显子1000G／A及第18外显子5’端剪接点5个碱基插入／缺失（insertion／deletion，IZD）多态与中国北方帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）和特发性震颤（essential tremor，ET）的关联。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对87例PD、73例ET和100名健康对照者A2MG／A和I／D两个位点的基因型和等位基因分布频率进行检测。结果（1）A2M基因G／A位点基因型和等位基因分布，在PD与ET、对照组间差异有统计学意义（P〈0．05），PD组的G等位基因和GA基因型明显高于ET、对照组（P〈0．05）；而ET与对照组间相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）A2M基因IZD位点基因型和等位基因分布，在PD、ET、对照组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论（1）G／A位点多态与PD的发病有关联，G／A位点多态与ET无关。（2）I/D位点多态与中国北方PD、ET无关。     

中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成

目的了解中国人苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase,PAH）基因的突变构成。方法应用PCR单链构象多态结合序列分析检测230例苯丙酮尿症患儿PAH基因全部外显子及其两侧内含子。结果（1）在460个PAH等位基因中检测出75种不同的突变基因,总检测率达94.6%（435/460）,其中3种突变基因（S251-R252〉SfsX89、Y387D和A389G）尚未见到报道。常见的突变基因为：R243Q（21.7%）、EX6-96A〉G（10.2%）、R111X（8.3%）、R413P（6.5%）和Y356X（6.1%）。较常见的突变基因为：V399V（4.1%）、IVS4-1G〉A（3.5%）、IVS7＋2T〉A（2.2%）和R241C（2.2%）。大部分突变集中在第3、5、6、7、11和12外显子及其两侧内含子区域。（2）检测出10种多态性位点,突变率高的4个位点IVS3-22C〉T（56.7%）、IVS10＋97G〉A（75.9%）、Q232Q（89.0%）和V245V（81.9%）,提示PAH基因cDNA序列存在人种差异。结论中国人PAH基因的突变构成与欧洲人群完全不同,与亚洲其它人群有频率的差异。     

前胡丙素对自发性及肾性高血压大鼠心肌组织ATP酶活性及酶促动力学参数的影响

目的：观察前胡丙素(Prc-C)对自发性高血 压大鼠(SHR)及肾性高血压大鼠(RHR)心肌细胞膜Na+，K+ -ATP酶及线粒体Na+，K+ -ATP酶、Ca2+ -ATP酶及M g2+-ATP酶活性及酶促动力学参数的影响。方法：采用光电比色法 测定ATP酶活性,并通过测定不同ATP浓度时的ATP酶活力,根据Lineweaven-Burk公式作图并 经加权线性回归法拟合直线,进而推算酶促反应动力学参数Km及Vmax。结果:〖 HTSS〗SHR及RHR心肌Na+，K+ -ATP酶及Ca2+ -ATP酶活性下降,最大反应速度(Vma x )降低。酶促动力学研究发现ATP酶反应速率常数(Km)在SHR增大,在RHR无显著性改变；Pra -C长期给药可加强酶活力,升高酶Vmax 而不影响Km。结论：SHR及RHR心 肌ATP酶变化存在差异，RHR心肌ATP酶活力的下降主要因为心肌组织ATP酶含量减少,而非酶 与底物ATP的亲和力变化；而SHR 心肌ATP酶活力的下降由于心肌组织ATP酶含量减少及酶与 底物ATP的亲和力下降两方面原因。前胡丙素长期用药可增加单位重量心肌组织ATP酶含量,但不影响酶与底物ATP的亲和力。     

蒙古族原发性高血压人群与血管紧张素转换酶ACE I/D基因及血管紧张素原AGT M235T基因多态性的关系

目的研究血管紧张素转换酶（ACE）基因及血管紧张素原（AGT）基因多态性与蒙古族原发性高血压病的关系。方法应用PCR-RFLP技术检测96例原发性高血压患者与正常对照组108名健康受试者血管紧张素转换酶基因第16内含子I／D多态性及血管紧张素原基因第二外显子M235T多态性。结果①蒙古族人群ACE基因I／D位点II、ID、DD基因型频率在高血压组和正常血压组分别为0.44、0．38、0．18和0．42、0．32、0．26，差异无显著性（χ^2=1.693，P=0．192，OR=0．643，95％可信区间0．330-1．254）；②I、D等位基因的频率分别为0．63、0．37和0．58、0．42，差异无显著性（χ^2=0．808，P=0.363，OR=0．834，95％可信区间0．560-1．240）；③AGT M235T位点MM、MT、TT基因型的频率在高血压组和正常血压组分别为0．21、0.73、0．06和0．55、0．34、0．11，两组之间差异无显著性（χ^2=0．495，P=0．482，OR=0．681，95％可信区间0．233-1．993）。④M、T等位基因频率分别为0．58、0．42和0．72、0．28，差异无显著性（χ^2=0．051，P=0．821，OR=1．047，95％可信区间0．702-1．562）；⑤同时分析AGT基因M235T基因型与ACE基因I／D基因型时结果为它们在蒙古族人群患高血压方面无协同作用。各亚组比较高血压组与对照组均无统计学差异，P〉0．05。结论血管紧张素转换酶基因I／D基因型和血管紧张素原基因M235T基因型与蒙古族人群发生原发性高血压无关。     

中国人群中精神分裂症与22号染色体的连锁不平衡研究

目的 探讨精神分裂症易感基因与22号染色体的分子遗传学联系,寻找、定位精神分裂症的易感基因。方法 在中国汉族人群中,选择了22号染色体上6个二核苷酸重复标记位点,应用荧光标记半自动基因分型技术,对126个精神分裂症同胞对核心家系进行基因分型和连锁不平衡检验（transmission/disequilibrium test,TDT)。结果 IL8Rβ位点TDT－χ^2值为25．30,P值为0．01,具有统计学意义,显示IL－2Rβ与精神分裂症的易感基因存在连锁不平衡;其他D22S944、D22S264、D22S303、D22S278、CYP2D6五个位点的P值均大于0．05,不存在连锁不平衡。结论 IL2Rβ基因或邻近区域可能存在精神分裂症的易感基因。     

TIM4基因多态性与湖北汉族变应性哮喘的相关性研究

目的分析湖北地区汉族人群T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白4（T cells immunoglobulin domin and mucin domain protein 4，TIM4）基因8570G〉A、11515C〉A单核苷酸多态性，探讨其与变应性哮喘易感性之间的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性对145例变应性哮喘患者和130名健康对照T／M4基因8570G〉A和11515C〉A多态性进行分析，计算基因型和等位基因频率。结果湖北地区健康人群TIM48570G〉AGG、GA和AA基因型频率分别是0．985、0．015和0，而哮喘患者其频率分别为0．931、0．069、0，基因型和等位基因频率在病例组与对照组间差异有统计学意义（P=0．030，P=0．032）；未检测到T／M4基因11515C〉A的多态性。结论湖北汉族人群T／M4基因8570G〉A存在单核苷酸多态性变异，可能与湖北地区汉族变应性哮喘易感性有关。     

APC基因甲基化定量检测芯片的建立

目的 建立抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli，APC）启动子1A的甲基化定量芯片检测方法。方法选取一段420bp的APC基因启动子1A CpG密集序列作为靶序列，针对M0、M1、M2、M3、M4 5个CpG靶位点，设计一套检测甲基化与非甲基化的探针。采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品。结果甲基化阳性、阴性质控的芯片结果与测序吻合。每组探针中荧光强度由强至弱依次为，阳性质控（甲基化）：探针1〉2、3〉4；阴性质控（非甲基化）：探针3〉4、1〉2。5个位点的5条荧光强度标准曲线，尺。范围是0．93～0．99。M0、M1、M2、M3、M4 5个位点甲基化杂合型的检测范围分别为50．0％±3．6％、50．0％±6．9％、50．0％±3．5％、50．0％±8．5％、50．0％±7．3％。结论建立了APC基因启动子5个COG位点的甲基化定量检测芯片。     

利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体

目的抗Aβ神经毒性的Aβ靶向肽噬菌体的筛选。方法分别合成Aβ1-10序列组成的短肽并将其生物素化;以生物素化Aβ1-10为靶分子,用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力的噬菌体;采用生物传感分析技术,通过结合特异性实验和短肽竞争性抑制实验,检测所筛选的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关系。结果经过对靶分子Aβ1-10的3轮筛选,筛出了与Aβ1-10特异性结合的单克隆噬菌体;生物传感分析技术结果进一步表明,靶分子（Aβ1-10）与所筛选噬菌体之间的结合具有高度特异性。结论筛选出了展示特异性高亲和力结合Aβ1-10短肽的噬菌体。     

磷酸二酯酶4抑制剂药效团模型的构建

目的 构建磷酸二酯酶4（PDE4）抑制剂药效团模型，为中草药的相关虚拟筛选研究提供新的方法。 方法 以22个具有PDE4抑制活性的化合物作为训练集化合物，其半数抑制浓度（IC50）范围在0．042～23000nmol·L^-1。利用Catalyst／HypoGen系统，对训练集化合物进行构象分析，通过对训练集化合物多个构象进行叠合，提取药效团特征及三维空间限制构建药效团模型。结合数据库搜索命中率筛选最优药效团。结果 最优药效团模型包含2个氢键受体、1个脂性疏水基团和1个芳香环特征，排除体积数为6个。模型相关系数、Totalcost值、Fixedcost值、Nullcost值、△cost值和Configuration cost值分别为0．9047、117．7、90．84、180.4、62．7和15．71。利用所得较优模型对MDL药物数据报道数据库进行搜索，该模型的命中已知活性化合物数与命中已知活性化合物总数比值为58．95％。 结论 利用Catalyst系统构建的PDE4抑制剂药效团具有较好的预测能力，可作为提问结构用于数据库的搜索，有助于中草药中具有抑制PDE4活性的化合物的虚拟筛选研究。     

角质细胞生长因子对老龄鼠胸腺细胞增殖作用的研究

目的观察角质细胞生长因子（KGF）通过恢复胸腺上皮细胞（TEC）数量促进老龄鼠胸腺细胞增殖的作用。方法①体内实验：BALB／C小鼠10只，随机分为KGF处理组和对照组，每组各5只，连续7d分别给予皮下注射重组人KGF（5mg·k^-1·d^-1）和生理盐水，4周后检测小鼠胸腺和脾组织的细胞总数，流式细胞仪分别检测胸腺组织中CD4单阳性（CD4SP）、CD8单阳性（CD8SP）、CD4CD8双阳性（DP）、CD4CD8双阴性（DN）以及脾组织中CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的比例；②体外实验：鼠胸腺上皮来源的1C6细胞，分别经含不同浓度（25、50、100、200、400、800ng／ml）的重组人KGF和不含重组人KGF的完全培养液（对照组）作用24h，采用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖率。结果细胞计数和流式细胞仪检测显示，与对照组相比，KGF处理组平均胸腺细胞总数和CD4SP、CD8SP、DP、DN各T细胞亚群的平均细胞数以及KGF处理组平均脾细胞总数和CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的平均细胞数均有明显增加（均P〈0．05）。MTT法检测显示，在低浓度（〈200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加不断升高；当KGF浓度为200ng／ml时，1C6细胞增殖率达到最高值；而在高浓度（〉200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加又逐渐下降；与对照组比较，浓度为100、200、400ng／ml的重组人KGF对1C6细胞具有明显的促增殖作用（均P〈0．05）。结论KGF可通过恢复老龄鼠TEC数量以及促进胸腺细胞生成和增加成熟T细胞向外周输出而增强机体的免疫力。     

突变型Axin2对细胞增殖的影响及其机制的研究

目的Axin是新近发现的Wnt信号传导系统的抑癌基因，本文在体研究其羧基端缺失突变（mtAxin2）对细胞增殖的影响并探索其相关机制。方法采用pCMV-Flag—mtAxin2质粒瞬时转染293细胞，并用G418筛选稳定表达mtAxin2的细胞株；使用Dual—Luciferase报告检测系统检测Firefly和Renilla荧光酶活性，采用TrpanBlue染色方法检测细胞增值活性，用流式细胞仪检测mtAxin2对细胞周期的影响，应用Western blot方法检测mtAxin2对Wnt信号传导系统下游基因的影响，G0／1细胞同步化S期进入实验研究mtAxin2对细胞生长影响的机理。结果经G418筛选后在293细胞中获得的细胞株，westem blot检测可见明显的mtAxin2蛋白表达；Western blot和Dual—Luciferase报告检测系统显示在稳定表达mtAxin2的细胞株中β-catenin蛋白水平增加，TCF活性增高；通过Trypan Blue排除实验计数绘制细胞生长曲线，显示mtAxin2促进细胞的生长；流式细胞仪检测发现在稳定表达mtAxin2的细胞株中S期细胞的比例较高。Western blot结果显示在稳定表达mtAxin2的细胞株中β-catenin蛋白水平上升的同时，磷酸化的β-catenin蛋白水平却下降，下游基因产物CyclinDl和cdc2表达也增加；G0／G1期同步化细胞释放后12h流式细胞仪检测发现稳定表达mtAxin2的细胞株中S期细胞比例明显增加，为293细胞的2—3倍。结论Wnt信号传导系统在细胞生长中起重要作用，mtAxin2通过cyclinD1促进了细胞的增殖，发挥癌基因的作用。     

粒细胞集落刺激因子治疗兔急性心肌梗死的时间窗研究

 目的 探讨应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员骨髓干细胞对兔急性心肌梗死的治疗作用及较佳的治疗时间窗。 方法 33 只健康大耳兔开胸结扎左室后支中下段建立心肌梗死模型后，随机分为对照组（9 只）、早期动员组（12 只）、延迟动员组（12 只）。对照组于心肌梗死后第 3 小时皮下注射生理盐水；早期动员组和延迟动员组分别于心肌梗死后第 3 小时和第 7 天开始皮下注射 G-CSF，每天 1 次，每次 20 μg/kg，连续 5 d。模型制备前和制备成功后 7 、28 d 行超声心动图检查，测量左室舒张末期内径（Dd）、收缩末期内径（Ds）并计算左室短轴缩短率[（Dd－Ds）/Dd]，测量左室后壁厚度和左室射血分数；心肌梗死后 28 d 取心脏做心肌组织病理学检查和内皮细胞 Ⅷ 因子免疫组织化学染色，计算心肌梗死总面积占左室总面积百分比和心肌毛细血管内皮细胞 Ⅷ 因子染色阳性率。 结果 心肌梗死后 28 d，延迟动员组兔心脏结构与功能均有明显改善，左室短轴缩短率（0.30 ± 0.05）、左室后壁厚度（0.19 cm ± 0.02 cm）和左室射血分数(56.7% ± 3.4%)均大于对照组(分别为 0.20 ± 0.02、0.17 cm ± 0.02 cm、47.7% ± 3.5%，均 P < 0.05）；心肌梗死面积占左室总面积的（18 ± 3）%，低于对照组的（22 ± 2）%（P < 0.05）和早期动员组的（21 ± 2）%（P < 0.05）；梗死区心肌毛细血管内皮细胞Ⅷ因子染色阳性率（90.8%）明显高于对照组（25.2%，P < 0.01）和早期动员组（72.0%，P < 0.05）。实验结束时，动物病死率延迟动员组为 16.7%（2/12），早期动员组 25.0%（3/12），对照组 33.3%（3/9），延迟动员组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 骨髓干细胞动员治疗心肌梗死可明显改善心脏功能；心肌梗死后 7 d 是进行骨髓干细胞动员的较佳时间窗。     

siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响

目的探讨跨膜转运蛋白21（TMP21）对γ分泌酶活性的影响。 方法将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF（KO）]分为转染组（T）和对照组（C），转染组转染载有TMP21小分子干扰RNA（siRNA）的质粒，对照组转染空质粒。每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品（T1、C1），经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品（T2、C2），用γ分泌酶组分早老蛋白1（PS-1）特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品（IPT2、IPC2）。蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP21、PS-1和Nicastrin（NCT）蛋白表达量；应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β＆#61472;淀粉样肽42的生成总量。 结果蛋白质印迹法检测显示，TMP21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为（5294±247）ng/ml，在对照组样品IPC2中为（19110±579）ng/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.05）；各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化；TMP21可与PS-1共沉降。ELISA法检测显示，转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（348±18）pg/ml，对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（342±18）pg/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论TMP21可能为γ分泌酶的组分之一。在TMP21蛋白低表达状态下γ分泌酶活性升高，提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。     

重组鼠疫组分疫苗毒理学研究

目的研究重组鼠疫组分疫苗的毒理学作用以评价其安全性,为进一步临床研究提供实验依据。 方法对重组鼠疫组分疫苗进行急性毒性试验,将疫苗1次给予小鼠后,观察所产生的毒性反应和死亡情况,及小鼠对该药物的最大耐受量。分别进行小鼠和豚鼠的异常毒性试验,观察动物有无异常反应,7d后每只动物体重变化。进行家兔的局部刺激试验,注射给药后对动物和注射部位进行肉眼观察,取注射局部皮肤组织进行病理检查。进行豚鼠的全身过敏试验,将致敏的动物静脉快速注射攻击,观察豚鼠有无过敏症状。 结果2种浓度疫苗经腹腔和皮下2种途径注射小鼠,均未引起小鼠的异常症状和死亡,小鼠对重组鼠疫组分疫苗的最大耐受量大于10000μg／kg。小鼠和豚鼠的异常毒性试验表明,注射后7d每组动物均全部健存、无异常反应,且7d后每只动物体重均有增加,均符合2005年版《中华人民共和国药典》三部要求。局部刺激试验中疫苗对家兔注射局部皮肤未引起明显的组织病理学改变。全身过敏试验未出现任何异常反应。 结论重组鼠疫组分疫苗的急性毒性试验、异常毒性试验、局部刺激试验和全身过敏试验毒理学实验结果显示,重组鼠疫组分疫苗用皮下注射的途径进行免疫是安全的。     

金黄色葡萄球菌 eap 基因的克隆与表达

 目的 构建携带 eap 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的重组 EAP 融合蛋白。 方法 PCR 法扩增金黄色葡萄球菌基因组 DNA，回收、 纯化的扩增产物与 pMD18-T 载体相连接得重组质粒 pMD18-T-EAP，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；未酶切组作为对照组重组质粒 pMD18-T-EAP 和 pET28a（+）表达载体分别用 Nde I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切、连接，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；空载体作为对照组。用不同浓度（终浓度 1、2、4、8 mmol/L）和不同诱导时间（1、2、3、4、5、6 h）的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性重组菌进行表达优化，分别取 E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用 MagneHis^TM 蛋白纯化系统纯化重组 EAP 融合蛋白，并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。 结果 所获 eap 基因与 GeneBank 的基因序列同源性 > 99%；氨基酸同源性达 100%。重组质粒经 IPTG 诱导，阳性重组菌转化子均有表达；当吸光度（A ）值等于 0.6 ~ 0.8 时，相对分子质量约 70 000 处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌 pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚，沉淀中几乎看不到。终浓度 1 mmol/L 为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG 诱导 1 h 重组 EAP 融合蛋白有一定量的表达，随着时间的延长，表达量增加不明显，3 h 时的表达量达最高，之后，蛋白表达量变化不明显。表达的重组 EAP 融合蛋白含量占全菌体蛋白的 29.6%。 结论 成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组 EAP 融合蛋白，为进一步研究以 EAP 蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。