基于DNA条形码和HRM技术建立紫草药材的RFLP-HRM鉴别方法

目的:基于DNA条形码技术和高分辨率熔解曲线(HRM)技术鉴别紫草市场样品的真伪并建立紫草药材的RFLP-HRM鉴别方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对紫草药材的ITS2序列进行扩增;利用MEGA 6.06软件对紫草药材的ITS2序列进行NJ树聚类分析和遗传距离分析;对市场中紫草非药典品进行基原确证;针对紫草药材的ITS2序列利用Primer Premier 5软件进行引物设计;对经设计、合成的引物通过HRM实验进行筛选;建立紫草药材的RFLP-HRM鉴定方法。结果:通过对紫草药材的ITS2序列进行NJ树聚类分析和遗传距离分析,可以有效区分新疆紫草、疏花软紫草、黄花软紫草及市场上非药典来源的紫草药材(紫草非药典品);经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出4对引物进行合成;通过HRM实验筛选出引物Zcf-1为最佳实验引物;确立了有效鉴别紫草市场药材的RFLP-HRM方法。结论:通过DNA条形码和HRM技术均能有效鉴别紫草市场药材真伪,且结果一致,起到互相验证的作用,建立了紫草市场药材的RFLP-HRM鉴定方法,为紫草及其他中药民族药品种的快速鉴定技术提供了可以参...     

基于DNA条形码和PCR-RFLP技术的进口紫草ITS2序列特征研究

目的:基于DNA条形码和PCR-RFLP技术研究进口紫草ITS2序列的特征,为市场紫草药材和饮片的质量控制与真伪鉴别提供参考依据。方法:选用ITS2区域作为对进口紫草和紫草对照药材进行比较、鉴定的DNA条形码序列,并基于DNA条形码和PCR-RFLP技术比较不同来源进口紫草的ITS2序列与紫草对照药材的异同。结果:39份进口紫草样品经限制性内切酶AluI酶切后,其产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,仅DH3在500 bp左右有条带,而在100～300 bp无条带,其余样品均在100～300 bp有2条或3条明显条带;进口紫草样品与紫草对照药材的ITS2序列进行比对,其中样品DH3与紫草对照药材的碱基差异最多,有15个碱基差异,样品F2与紫草对照药材的ITS2序列一致,其他进口紫草样品与紫草对照药材的碱基差异为1～9个碱基;从聚类结果中可以看出进口紫草样品DH3与其他进口紫草样品和紫草对照药材均明显区分,独自为一枝,而与紫草对照药材共同聚为一枝且支持率≥50%的样品共有14个。结论:选用ITS2区域,基于DNA条形码和PCR-RFLP技术,比较了进口紫草与紫草对照药材ITS2序列的异同,为...     

巴戟天饮片及其混伪品的鉴别研究

目的:基于DNA条形码技术、传统经验鉴别和理化鉴别技术区分巴戟天饮片及其混伪品。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),对巴戟天的内部转录间隔区2(ITS2)序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行BLAST比对,以及利用构建NJ树的方法推断巴戟天饮片及其混伪品的基原;比较巴戟天饮片及其混伪品的种内、种间差异;比较巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为差异。结果:巴戟天饮片及其混伪品经NJ树聚类分析和与GenBank进行BLAST比对,结果显示巴戟天饮片与其混伪品分支明显,11批巴戟天混伪品被鉴定到7个种,分别为印度羊角藤(羊角藤)、蔓虎刺、硃砂根、木通、黑老虎、合蕊五味子(铁箍散)、南五味子;种内、种间变异分析结果显示,5批巴戟天饮片的种内遗传距离为0.000,巴戟天饮片与其他7个混伪品的最小种间遗传距离为0.037;巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为存在差异。结论:基于DNA条形码技术可有效区分巴戟天饮片及其混伪品,为巴戟天饮片正伪品的鉴别以及标准提升工作提供了一定的依据。     

基于DNA条形码和特异性PCR技术鉴别蚂蟥及其常见伪品

目的：建立蚂蟥特异性PCR鉴别方法,能够快速准确地鉴别蚂蟥与其常见伪品。方法：通过分析蚂蟥与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列,寻找蚂蟥SNP变异位点,设计特异性引物;通过对退火温度、循环次数、DNA模板量及Taq酶等关键因素的考察,确立最优反应体系及条件,并将特异性PCR方法应用到水蛭（蚂蟥）粉末中进行药材粉末的基原鉴别,同时为保证试验结果的准确性,将PCR扩增产物进行一代测序。结果：特异性PCR结果表明蚂蟥在400～600 bp有单一明亮条带,常见混伪品则无此条带,试验结果与一代测序结果一致,为蚂蟥。结论：该方法能够将蚂蟥与其常见伪品菲牛蛭、东北小水蛭、黑条、小黑条等区别,且能鉴别水蛭（蚂蟥）粉的基原,为提升中药监管力度,打击中药掺伪行为提供了强有力的技术支持。     

基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭

目的：通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果：通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论：通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。     

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性,建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析,寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物,优化PCR反应体系与程序,进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别,所建立的位点特异性PCR鉴别方法,在退火温度为56℃、循环数为33次时,伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后,在200～300 bp之间检出一条单一DNA条带,而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血,为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。     

菊科藏药材及其近缘物种的分子鉴别

目的 评估ITS2(internal transcribed spacer 2)序列作为DNA条码鉴定菊科藏药材及其近缘物种的能力。方法 于西藏自治区等地采集菊科植物样本50份,共26个物种,分布于8个属,它们大部分可以用作藏药材。采用遗传距离比较法和系统聚类树法评估ITS2序列的鉴定能力。首先,采用试剂盒法提取基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并双向测序。从GenBank数据库中下载26种菊科植物的rDNA序列(包含完整的ITS2区域)。上述序列经过CodonCode Aligner v.9.0.1软件拼接后,用MEGA 11.0.10软件构建NJ系统聚类树,用TaxonGap v.2.4.1软件分析种内和种间变异。结果 采用系统聚类树法和遗传距离比较法,ITS2序列可以从3种蒿属植物中鉴别出大籽蒿(Artemisia sieversiana),6种紫菀属植物中鉴别出灰枝紫菀(Aster poliothamnus),2种垂头菊属植物中鉴别出车前状垂头菊(Cremanthodium ellisii)和条叶垂头菊(Cremanthodium lineare),3种风毛菊属植物中鉴别出美丽风毛菊(Saussurea superba),并且可以将小苦荬属的中华小苦荬(Ixeridium chinense)和窄叶小苦荬(Ixeridium gramineum)区分开,可以将毛香火绒草(Leontopodium stracheyi)、三角叶蟹甲草(Parasenecio deltophyllus)与其他物种区分开。ITS2序列可以成功地从26个菊科物种中鉴别出9个物种,鉴定效率为34.6%。结论 ITS2序列可以用于快速、准确地识别和鉴定部分菊科藏药材。     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

基于DNA条形码ITS2序列对阿魏属药用植物的鉴别研究

目的:建立一种快速、准确和标准化的中药材阿魏属植物DNA条形码鉴别方法。方法:提取新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)和阜康阿魏(Ferula fukanensis K.M.Shen)基因组DNA,扩增ITS2序列并测序;运用分析相似性搜索法,下载Gen Bank数据库中阿魏属植物13个物种26个样本基因ITS2序列并进行比对分析,计算种间种内遗传距离并构建系统进化树进行聚类分析。结果:通过计算,15个物种遗传距离分布范围为0.009~0.230,平均遗传距离为0.018;聚类分析结果显示DNA条形码ITS2序列能够将阿魏属32种植物聚为不同的类。结论:建立的阿魏药材DNA条形码ITS2序列鉴别方法可准确、快速地鉴别出阿魏属药材的正品和混淆品。     

基于DNA条形码序列分析的5种菖蒲属药用植物鉴定

目的构建菖蒲属药用植物的鉴别方法。方法采用DNA条形码序列技术,对5种菖蒲属药用植物的4条候选DNA条形码序列(ITS2、rbc L、mat K、psb A-trn H)进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,对比分析种内、种间的遗传变异、分析barcoding Gap并构建聚类分析树。结果 4条候选DNA条形码序列PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对菖蒲属药用植物的鉴定成功率最高。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术可以鉴定菖蒲属药用植物。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定.方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon?Code?Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析...     

金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重PCR鉴定方法的建立

目的:建立金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:以线粒体Cytb基因为靶基因,设计特异性引物,优化引物最适退火温度与最佳浓度比,并用该方法进行混合样品的检测。结果:金钱白花蛇、乌梢蛇与蕲蛇的引物(浓度均10μmol·L^-1)在57℃时特异性均非常好,最佳浓度比为0.6∶1.0∶1.8时分别扩增出185、235、343 bp的特异性条带,混淆品及空白对照无条带。该方法能同时、准确地鉴定出混合样品的蛇源成分。结论:本方法可同时、准确、快速地鉴定金钱白花蛇、乌梢蛇和蕲蛇样品,并适合粉末样品鉴别。     

PCR-核酸试纸条检测方法鉴别蛤蚧真伪

目的:蛤蚧为我国的名贵中药材,建立PCR-核酸试纸条检测方法对蛤蚧进行定性鉴别。方法:通过碱裂解法提取蛤蚧及其伪品的基因组DNA,以蛤蚧细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)为靶基因,设计特异性引物,确定合适的PCR-核酸试纸条反应体系以及反应条件。结果:通过PCR-核酸试纸条对蛤蚧进行定性分析,正品蛤蚧在PCR-核酸试纸条上均出现2条带,伪品以及阴性对照均出现1条带。结论:PCR-核酸试纸条检测方法可实现短时间内蛤蚧可视化检测,操作方便,结果准确,可以为蛤蚧的DNA分子鉴别提供技术保障。     

道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒的研制与评价

目的 建立一种将DNA提取技术与PCR技术相结合的天麻DNA真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的ITS2序列,应用DNAMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用DNA提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组DNA,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果 应用所研制的试剂盒提取样品DNA,纯度OD260 /OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^-1,3次重复性检测结果相同,反复冻融 5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20 ℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论 道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。     

蒙药材草乌叶DNA条形码研究北大核心CSCD

目的:建立草乌叶与其易混品的分子鉴定方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对草乌叶及9种混伪品的候选序列(ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH)进行扩增,比较各序列的扩增效率和测序成功率,并进行种内、种间遗传变异分析和barcoding gap分析。结果:ITS和ITS2序列GC含量较高,种间变异明显大于种内变异,根据barcoding gap图显示种内、种间遗传距离重叠较小,适合物种的区分,基于K2P距离进行聚类分析,ITS序列呈现较好的单系性。结论:ITS序列可应用于蒙药材草乌叶与其混伪品的鉴定,为民族药鉴定提供新方法。     

麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的PCR-RFLP鉴别方法研究

目的:通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP法)建立一种能快速鉴别麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的方法。方法:对麦冬和山麦冬的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对,选择山麦冬的特异性酶切位点PmlI,设计PCR-RFLP反应引物。以退火温度58℃、循环数为30,LR-F和LR-R鉴别引物(10μmol·L^-1)各0.5μL,PmlI限制性内切酶在37℃酶切2 h的反应条件为PCR-RFLP法的参数,并进行方法学考察和统计分析。结果:在退火温度58℃、循环数为30时,山麦冬或掺有山麦冬的麦冬样品经过特异性引物扩增后,能被PmlI限制性内切酶酶切,在100～250 bp之间检出2条单一DNA条带,麦冬样品则无此条带。该方法稳定性好,专属性强,能对麦冬与山麦冬饮片及掺混样品进行鉴别,并对麦冬中掺入山麦冬的检出限为5%。结论:建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好,灵敏度高,实现了麦冬与山麦冬饮片及麦冬中掺混山麦冬的快速检测,可用于麦冬与山麦冬药材真伪鉴别的补充检验方法。     

紫苏属药用植物的rDNA ITS区SNP分子标记与位点特异性PCR鉴别

目的分析单种属——紫苏属各变种间rDNA ITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性(SNP)现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。方法对紫苏属各变种多个体的rDNA ITS区全序列进行了准确测定，运用Clustral X 1.8，MEGA 3.0进行排序并进行SNP分析，从而设计出鉴别各变种的等位基因位点特异性PCR鉴别引物。结果紫苏属各变种(紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等)的rDNA ITS区全序列共有615～618 bp的长度，ITS1为233～235 bp，5.8S为179 bp，ITS2为203～204 bp，GC含量为61.5%～61.9%。从rDNA ITS区碱基变异的整体情况来看，紫苏属各变种间不仅在非编码的转录间隔区ITS1和ITS2内存在非编码区单核苷酸多态性(ncSNP)，而且在保守的5.8S编码区内也存在3个位点的单核苷酸多态性，即编码区SNP(cSNP)，所有的SNP均只具2等位多态性。5.8S区cSNP的出现与产生该变异的变种出现的显著形态差异关联。本文还利用这些SNP位点设计出了鉴别紫苏属各变种的位点特异性PCR引物，无需测序即可对紫苏属的原植物及“苏子”、“苏叶”等药材进行有效准确的分子鉴别。结论紫苏属药用植物rDNA ITS区存在的SNP可用作紫苏属各变种鉴别的分子标记。     

基于DNA宏条形码技术的中药材苦杏仁表面真菌多样性研究

苦杏仁为药食两用品种,因其富含油脂等营养物质而易受到真菌污染.本研究基于DNA宏条形码技术对苦杏仁中污染真菌的多样性进行分析,为其安全使用提供参考依据.收集来自4个药材市场和3种炮制规格的苦杏仁样品共12批,提取真菌DNA并扩增ITS2序列,基于Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序.结果 表明子囊...     

金钱白花蛇及其伪品的Cyt b基因片段序列分析和PCR鉴别研究

对金钱白花蛇及其伪、混品药材和原动物的Cyt b基因片段的序列分析发现,该基因片段在金钱白花蛇及其伪品间的差异远远大于金钱白花蛇种内个体间的差异,是理想的用于鉴别金钱白花蛇及其伪混品的分子遗传标记。在对Cyt b基因片段序列分析的基础上,设计了金钱白花蛇PCR鉴别的一对高度特异性引物BuL-1和BuH-1。结果表明,该对引物在对金钱白花蛇的PCR鉴别中,用60℃～65℃的复性温度,可以100%检出金钱白花蛇,误检率和漏检率为0,并能在混合的药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇组份。本研究还表明PCR鉴别将有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。