道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒的研制与评价

目的 建立一种将DNA提取技术与PCR技术相结合的天麻DNA真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的ITS2序列,应用DNAMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用DNA提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组DNA,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果 应用所研制的试剂盒提取样品DNA,纯度OD260 /OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^-1,3次重复性检测结果相同,反复冻融 5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20 ℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论 道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。     

基于PCR的麦冬鉴别方法研究

目的：建立中药材麦冬的PCR检测方法。方法：对麦冬及其混伪品的ITS序列进行比对分析,在ITS 1区设计了麦冬的特异性引物,并通过对PCR反应条件的优化,建立麦冬的PCR鉴别方法。结果：建立了麦冬真伪鉴别的PCR检测方法,并利用该方法对收集的样品进行检测,实现了麦冬与混伪品的准确鉴别。结论：该方法操作简单、特异性强、重复性好,检测结果客观易判读。     

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性，建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析，寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物，优化PCR反应体系与程序，进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别，所建立的位点特异性PCR鉴别方法，在退火温度为56℃、循环数为33次时，伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后，在200～300 bp之间检出一条单一DNA条带，而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血，为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。     

适用于不同产地半夏药材的特异性引物PCR鉴定分析方法

目的:通过特异性引物PCR技术,建立不同产地半夏药材通用的聚合酶链式反应(PCR)鉴别法。方法:提取不同产地半夏药材的基因组DNA,利用特异性引物对基因组DNA进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行分析。结果:所设计的引物能够特异性地扩增出半夏的目的DNA,并适用于全国9个主要不同产地半夏药材的检测。结论:该方法具有较强的特异性和普适性,适用于半夏药材的真伪性鉴别。     

基于Cyt b基因的PCR技术对牛鞭药材的鉴定方法研究

目的:建立对牛鞭药材的聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,从分子水平上对牛鞭药材的真伪进行鉴定。方法:提取牛鞭及其伪品(驴鞭、猪鞭、羊鞭)的基因组DNA,并对其完整性、纯度和浓度进行检测。利用GenBank相关信息,以牛鞭的线粒体细胞色素b基因(Cyt b)为靶基因,应用Primer-BLAST在线软件设计特异性引物,并对不同物种鞭类样品进行PCR扩增,对产物进行电泳分析;对获得的牛鞭样本PCR产物进行克隆和DNA测序验证。对所建立的PCR鉴定方法进行特异性和重复性考察验证。结果:提取所得的牛鞭及其伪品DNA的纯度较高,无蛋白质或RNA污染;1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示,牛鞭样本在200～300 bp之间均出现明显的目的基因条带,而其他伪品未见相应条带出现。DNA测序结果证实,所获牛鞭样本基因片段的核苷酸序列与GeneBank中牛鞭物种相似性均为100%。方法学验证结果显示所建方法特异性、重复性均良好。结论:本研究所建基于Cyt b基因的PCR鉴定方法简单、快速,准确性、特异性、重复性均良好,可满足牛鞭及其伪品的分析鉴定需求。     

婴儿健脾散中川贝母荧光PCR检测方法的建立及应用

目的 探讨双重实时荧光PCR检测方法对婴儿健脾散中川贝母成分真伪鉴别的可行性。 方法 使用特异性Taqman引物和探针建立双重荧光PCR检测法，对川贝母及其常见伪品进行鉴别，并对其灵敏度、特异性和自制模拟婴儿健脾散处方进行评估。进一步使用该方法对市场流通的婴儿健脾散中的川贝母真伪进行检测。结果 建立的双重实时荧光PCR检测方法特异性高，灵敏度达0.0001ng/μL；对49批婴儿健脾散样品抽查检出6批不合格，其中2批未检出贝母属成分，4批检出贝母属成分但未检出川贝母成分。结论 本双重实时荧光PCR法可成功鉴定婴儿健脾散中川贝母的真伪，可为含川贝母成分复方制剂的川贝母真伪鉴别提供依据。     

中药材茯苓PCR鉴定与特征

目的:建立针对真菌类中药材茯苓的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定技术,从分子生物学角度出发,对茯苓的真伪进行鉴定。方法:对经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行改良,提取样品基因组DNA,以茯苓内转录间隔区(internal transcribed space, ITS)为目的序列,设计特异性引物,优化PCR反应体系,建立茯苓PCR鉴定方法,同时克隆特异性扩增的目的条带,测序鉴定其准确性,最后进行方法学验证。结果:提取的基因组DNA浓度较高、纯度较好、完整度良好。琼脂糖凝胶电泳结果表明正品茯苓可以在199 bp处出现单一明亮的特异性扩增条带,而伪品不出现扩增条带,引物的特异性为100%,克隆后的目的片段电泳图谱清晰明亮,克隆片段与Genbank数据库中已登记的茯苓物种序列相似性高达100%。在操作人员不知样品真伪的情况对样本检测,目标条带出现位置与预期一致;灵敏度检测结果表明,DNA检测下限可达1 ng·μL^-1;挑选3位实验室人员进行茯苓真伪检测,结果相同且和预期一致,建立的茯苓PCR鉴定方法特异性良好,准确...     

基于巢式PCR的紫草鉴别引物筛选

目的:基于巢式聚合酶链式反应(PCR)理念设计并筛选出可用于高效扩增与鉴别紫草市场样品真伪的特异性引物。方法:针对新疆紫草的ITS序列和紫草非《中华人民共和国药典》品ITS2序列,利用Primer Premier 5软件进行巢式引物设计;比较ITS2通用引物PCR和巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳检测;基于扩增产物片段长度、变异位点覆盖情况对设计的紫草药材特异性引物进行评价。结果:经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出11对引物进行合成;巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率明显优于ITS2通用引物PCR;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果明显优于ITS2引物直接扩增紫草基因组DNA,且呈单一条带;确定AE-9S/AE-2A、AE-4S/AE-10A、AE-12S/10A、AE-29S/AE-29A共4对引物适用于紫草正伪品鉴定。结论:在DNA条形码鉴定和巢式PCR技术的基础上,确定了4对可以用于有效区分药材市场中主流的新疆紫草和紫草非《中华人民共和国药典》品的特异性...     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

傅里叶红外光谱法鉴别巴戟天及其伪品的研究

目的:为了快速准确地鉴别巴戟天及其伪品。方法:采用傅里叶红外光谱法对巴戟天药材及其常见伪品羊角藤、铁箍散、假巴戟和恩施巴戟进行测定,通过比较一、二级红外谱图相似度和特定谱段相似系数对其真伪进行分析。结果:在一、二级红外谱图上均可根据特征峰比对分析法和特征谱段相似系数法快速鉴别巴戟天及其伪品。结论:红外光谱法用于巴戟天药材真伪鉴别准确、快速,可以作为巴戟天药材真伪鉴别的一种现代化检测方式。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

CAT基因突变热点区域的PCR扩增方法

目的探讨过氧化氢酶基因突变热点区域PCR扩增方法,提高PCR反应的特异性和灵敏度,有助于快速检测CAT基因相关疾病。方法从人静脉血液标本提取人血液基因组DNA,设计引物扩增特定的CAT基因片段,联合应用热启动PCR和降落PCR技术。结果建立了重复性好,分辨率高的PCR反应体系。结论建立了适用于CAT基因突变热点区域的PCR反应体系,有助于快速检测CAT基因相关疾病。     

天麻的鉴别

目前,药材市场的天麻多以切片形式进行交易．给鉴别带来一定难度。为了防止天麻伪品流入市场．保证用药安全有效,我们采用显微鉴别、指纹图谱鉴别,快速准确。天麻始载于《本经》．原名为赤箭。过去的天麻完全是野生品种．现在野生资源濒临灭绝,大部分天麻药材来源为栽培品种。目前市售天麻多为切片形式交易,看不到天麻外形,从性状鉴定上难分辨真伪．理化方面鉴定易造成混淆,给不法商贩造成可乘之机。因此,我们用下列几种方法进行快速、准确鉴别．保证患者用药的安全性、准确性、有效性。     

雷公藤药材基原考证及分子鉴定研究

目的 为确保雷公藤药材临床用药的安全性和有效性,对雷公藤药材基原进行文献考证,并建立特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法.方法 查阅文献对雷公藤基原进行考证;对雷公藤及混伪品DNA条形码进行对比分析,筛选具有稳定差异的特异性鉴别位点,设计鉴别引物,优选出特异性快速PCR扩增条件.结果 文献考证发现雷公藤和昆明...     

RNaseH依赖性PCR扩增结合熔解曲线法鉴别石菖蒲与藏菖蒲掺杂

目的 采用核糖核酸酶H依赖性PCR(rhPCR)扩增结合熔解曲线分析对石菖蒲与藏菖蒲进行快速鉴定及相互掺杂检测。方法 比对分析石菖蒲与藏菖蒲核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列，寻找稳定的单核苷酸多态性(SNP)位点设计特异性扩增引物，根据扩增产物熔解温度(T_m)不同进行鉴别，考察引物特异性，筛选最佳混合引物比例，并考察该方法灵敏度、掺混检出限及适用性。结果 设计的特异性引物具有良好特异性，石菖蒲、藏菖蒲扩增产物可分别产生(89.4±0.2)与(87.9±0.2)℃的单一特异性熔解曲线峰。所建立的方法灵敏度高，DNA检出限均为0.1 ng,对石菖蒲和藏菖蒲的掺混检出限均为10%。检测样品28份，其中石菖蒲16份、藏菖蒲12份，检测结果与DNA条形码结果一致。结论 该研究基于RNase H依赖性PCR扩增结合熔解曲线建立的石菖蒲及藏菖蒲鉴别及掺杂检测方法可有效鉴别石菖蒲、藏菖蒲及掺杂样品，有利于石菖蒲药材质量控制。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

紫外谱线组扫描法鉴别大青叶药材的真伪

目的:通过紫外光谱组扫描法鉴别10批不同来源的大青叶药材的真伪,从而建立大青叶及其伪品的紫外光谱鉴别法.方法:利用紫外光谱组扫描法进行试验.结果:10批大青叶样品中有9批是伪品,只有1批是正品.结论:该方法简单,易操作,能快速鉴别大青叶及其伪品.     

安徽金寨产天麻药材HPLC指纹图谱的研究

目的 本研究旨在建立安徽金寨产区天麻药材的标准指纹图谱,以期建立鉴别产地药材真伪和质量优劣的评价标准.方法 主要是利用高效液相色谱法来进行天麻药材色谱指纹图谱的研究.结果 实验表明,采自金寨县不同产地的天麻药材,经适当处理后,会产生相当稳定和重现性强的HPLC图谱.结论 本研究所获得的方法可以用来鉴别金寨天麻药材的道地性和质量的优劣.     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

基于高分辨率熔解曲线技术鉴别酸枣仁及其混伪品理枣仁

目的：采用高分辨率熔解曲线技术(HRM)快速鉴别酸枣仁与相关混伪品药材理枣仁及理枣仁杂合品种。方法：采集了14份酸枣仁及10份市售混伪品理枣仁进行样品DNA提取,通过ITS2序列使用NCBI的 Primer-Blast设计引物,筛选引物浓度并对采集的样品进行检测分析。结果：在引物浓度为 10 μmol·L^-1的条件下,向反应体系加入0.3μL引物时,可获得优质的熔解曲线。应用该方法对14批酸枣仁及10批理枣仁均可进行HRM曲线分析鉴别,并且通过该方法能够准确区分理枣仁及理枣仁杂合品种;将理枣仁与理枣仁杂合品粉分别掺入酸枣仁样品中,HRM检测技术最低掺伪检测限为10%。结论： 基于HRM技术可实现酸枣仁与其常见混伪品理枣仁、理枣仁杂合品种的准确鉴别,对市场药材的快速检测及质量评估有一定应用前景。