NF-κB在高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织中的表达及其意义

目的：探讨高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织中NF-κB的变化规律及其意义。方法：雄性Wistar大鼠240只,分别在1517m和3848m两个海拔高度随机分为延迟复苏组（DFR,n=50）、即时复苏组（IFR,n=60）和对照组（CG,n=10）,建立30%Ⅲ度烫伤模型,分别于伤后1、6、12、24、72和168h取材,观察肺组织病理学改变及NF-κB的表达。结果：随着海拔高度增加,肺组织病理变化越明显,且DFR组较IFR组差异显著。NF-κB阳性表达位于肺泡上皮细胞核或胞浆,高海拔组表达强度高于低海拔组,实验组高于对照组,各海拔高度DFR高于IFR组（P〈0.05）。结论：NF-κB表达强度变化与高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织损伤有关。     

Wnt3a蛋白诱导BMSC定向分化并促进大鼠创面修复的实验研究

目的在细胞水平和动物模型整体层面观察Wnt3a诱导BMSCs定向分化并促进大鼠皮肤软组织缺损创面修复的过程。方法选取清洁级SD大鼠80只,雄性,3周龄,体重40~50g。全骨髓贴壁分离法获取大鼠骨髓来源间充质干细胞,所获取细胞经免疫荧光染色鉴定为干细胞。体外扩增后分为对照组及Wnt3a组,对照组用普通DMEM培养基培养,Wnt3a组以DMEM+Wnt3a信号通路激动剂Wnt3a(终浓度为200μg/L)培养。分别通过qRT-PCR和免疫荧光检测血管内皮细胞,周细胞及平滑肌细胞相关标志物的表达,验证Wnt3a在体外对BMSCs的诱导分化作用,并利用大鼠全层皮肤缺损模型作为研究对象,观察BMSC与Wnt3a联合应用对创面修复的促进作用。结果 RT-PCR的结果显示,Wnt3a组在加入Wnt3a激动剂培养7d以后,BMSCs的干细胞相关分子Klf4,Oct4表达水平相比对照组有相应下降(0.732±0.048,0.591±0.097,倍比数,P0.001),证实BMSCs发生了相应的分化行为。其中NG2、VEGF、CD31及α-SMA在Wnt3a组mRNA表达显著增高(P0.001)。整体动物水平,BMSC+Wnt3a联合应用组大鼠创面愈合率、肉芽组织形成及评分、创面成熟度及再血管化程度均高于空白对照组(P0.001)。RT-PCR结果显示代表创面修复所需关键细胞的标志物(NG2、VEGF、CD31及α-SMA)mRNA表达水平明显高于空白对照组(P0.01)。结论本研究通过体外及体内实验证实,利用Wnt信号途径激动剂的经典蛋白Wnt3a与BMSC共培养,能够提高干细胞活性,发挥其再生特性,并能够诱导前者定向分化为皮肤修复相关的关键细胞,因而加速肉芽组织重建和再生,最终促进创面愈合,为临床上BMSCs移植修复大面积皮肤软组织缺损提供了新的思路。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

经体外预处理人胎儿骨髓间充质干细胞的潜在自身成瘤性

目的评价经体外预处理、启动免疫保护功能的人胎儿骨髓间充质干细胞（hfBMSCs）的潜在自身成瘤性。方法采用流式细胞术检测细胞表型及细胞周期,染色体核型分析检测遗传稳定性,裸鼠皮下接种检测体内成瘤性。结果体外预处理的hfBMSCs呈正常间充质干细胞表型,可通过阻滞细胞周期于G0-G1期抑制hfBMSCs生长增殖（P〈0.05）,对染色体核型无影响,不具备体内成瘤性。结论经体外预处理的人胎儿骨髓间充质干细胞不具有自身成瘤性。     

人羊水来源MSC的分离培养鉴定及其免疫抑制特性的初步研究

目的：体外分离培养鉴定具有间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法：贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导分化为脂肪样细胞、成骨样细胞等方法进行鉴定后,以细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）体外检测人羊水来源间充质干细胞（amniotic fluid derived-mesenchymal stem cells,AFMSC）对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,并对其时效、量效关系进行分析。结果：具备MSC形态、表型及分化潜能特征的人羊水来源细胞,可于体外显著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖（P〈0．05）,时效、量效关系显著（P〈0．05）。结论：从免疫抑制特性角度证明羊水可成为替代骨髓的MSC新来源。     

人脐带间充质干细胞的高效分离及对小鼠免疫功能的影响

目的建立一种从健康人脐带中分离间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的简单、经济、高效方法,并探讨其对小鼠免疫细胞的影响。方法取经剖宫产获得的健康人脐带血管与外膜之间的胶状物并剪切成小于1 mm3的小块,用组织块贴壁法直接培养MSCs,并用获得的MSCs注射于健康C57 BL/6小鼠皮下。结果获得的MSCs高表达CD105、CD73、CD44和CD90,不表达CD34、CD45和人类白细胞抗原 DR,符合干细胞的各种生物学特性。结论用简便、经济的方法获得了健康人脐带间充质干细胞,注射C57 BL/6小鼠体内后,小鼠的血细胞及T细胞亚型未改变,自身免疫系统稳定,为进一步的研究奠定了实验基础。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

铁羧葡胺标记猪间充质干细胞的体内外磁共振成像研究

目的 探讨铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪骨髓间充质干细胞(MSC)的体外和活体心脏内MR成像的特点.方法 分离培养猪MSC,用含铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记细胞24 h.分别于标记后0、4、8、12、16、20 d行普鲁士蓝染色观察细胞内铁,原子吸收分光光度仪测定细胞内含铁量,锥虫蓝排除试验检测细胞活力.对不同时间点、不同细胞数的磁标记干细胞进行1.5 T MR仪体外成像,并对植入猪心肌内的标记细胞进行体内MR成像.结果 ①MSC标记后见胞质中大量普鲁士蓝着色颗粒,标记率达100%,铁离子含量平均为(13.13±2.30)pg/细胞;随细胞的分裂增殖,细胞内铁离子含量逐渐减少,16 d时铁离子含量下降到(0.68±0.20)pg/细胞,接近标记前水平[(0.21±0.06)pg/细胞,P＞0.05].干细胞磁标记后各时间点的锥虫蓝拒染率与未标记细胞无统计学差异(P＞0.05).②3种成像序列中GRE T2*WI信号改变最为明显,成像细胞数量越多,信号强度变化越明显.1×106个细胞进行MR成像,发现随着标记后体外培养时间延长,T2*WI磁标低信号逐渐消失,12 d以后信号强度和标记前无差异(P＞0.05).体外MR成像最少能检测到5×104～1×105个标记的猪MSC.③标记细胞心肌内移植后1周MR成像显示低信号区.结论 应用铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪MSC安全、高效;体外MR信号强度能一定程度上反映磁标记细胞的数量及增殖情况;1.5 T临床MR成像仪可对植入心脏的磁标记细胞进行活体显像示踪.     

烧伤大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞基因表达的影响

目的：观察烧伤大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)基因表达的影响。方法：分离Wistar大鼠骨髓,原代培养MSCs,传代后分别用含有体积分数为10％的正常大鼠血清(N组)和烧伤后3天大鼠血清(B组)的F-12培养基培养24h,然后以含有5705种基因的寡核苷酸微阵列检测两组细胞基因表达的差异。结果：两组MSCs对比,有4种基因表达存在明显差异。其中B组类固醇敏感基因-1(Ssg-1)表达减弱,而磷酸二羟基丙酮酰基转移酶(Gnpat)基因、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)基因和与骨形成蛋白-2可诱导激酶的序列有部分相同的一条EST表达增强。结论烧伤后大鼠血清刺激MSCs可使其基因表达发生改变,这种改变可能与MSCs受到刺激后参与创面修复有关。     

烫伤延迟复苏后细胞凋亡对肠粘膜通透性的影响

目的：探讨烫伤延迟复苏后肠粘膜细胞凋亡对其通透性的影响。方法：150只Wistar大鼠分为立即复苏(ER)、延迟复苏(DR)，N—乙酰半胱氨酸(NAC)和别嘌呤醇(Allo)治疗组及正常对照。采用DNA片段百分率(ap％)、电泳、TUNEL法观察回肠粘膜凋亡情况；并测定门静脉D—乳酸、内毒素以观察肠粘膜通透性改变。结果：伤后DR组ap％均显著高于ER组。NAC组ap％显著低于DR组。电泳、TUNEL法均观察到肠粘膜凋亡发生；ap％与D—乳酸、内毒素变化呈显著正相关。结论：烫伤延迟复苏后肠粘膜发生病理性凋亡，与其通透性变化密切相关；NAC可显著减轻延迟复苏所致肠粘膜细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

骨髓间充质干细胞对大鼠急性放射性肝损伤修复的研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠急性放射性肝损伤的修复作用。方法 雌性SD大鼠12只,肝右叶接受单次6MVX射线20Gy照射,建立急性放射性肝损伤模型;随机分成2组,干预组注射雄性大鼠BMSCs悬液,对照组注射等量生理盐水。4周后观察大鼠肝组织的病理形态学改变,采用原位杂交技术检测肝脏中性别决定基因Y(SRY)及免疫组织化学技术检测ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)的阳性表达。结果 两组大鼠肝右叶组织中均可见汇管区炎性反应及肝实质细胞的损伤,但干预组的损伤程度比对照组轻。干预组大鼠肝右叶中检测到的SRY阳性细胞多于肝左叶(t=3.77,P＜0.05),ɑ-SMA的阳性表达率低于对照组(t=2.25,P＜0.05)。结论 单次20Gy照射可以造成大鼠肝右叶急性放射性损伤;SRY阳性细胞可以被征募到大鼠的放射性肝损伤部位,在一定程度上可能减轻放射性肝纤维化的发生。