结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达

目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.     

热休克蛋白70与IL-2对荷瘤小鼠肿瘤切除术后治疗作用的比较

目的:比较肿瘤来源的热休克蛋白70(HSP 70)与白细胞介素2(IL-2)对荷瘤小鼠肿瘤切除术后的治疗作用.方法:液相色谱法纯化小鼠肿瘤细胞株中的HSP70,用SDS PAGE及Western blot对纯化产物进行定性分析,毛细管电泳鉴定其纯度.动物实验观察HSP 70与IL-2对荷瘤小鼠肿瘤切除术后的治疗作用.结果:单纯手术能延长小鼠的生存期限,HSP70 10μg组40%小鼠肿瘤最终全部消退,获长期生存(＞90d),平均生存(59.2±29.6)d,与对照组比较差异显著(P＜0.05).手术与HSP70 10μg联合应用组80%肿瘤完全消退,平均生存(82.0±17.9)d,与对照组、单纯手术组、手术联合应用IL-2 10万u组比较差异显著(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05).结论:手术能切除局部肿物,但术后易复发、转移,影响长期生存率.HSP 70具有明显全身治疗作用,适当剂量的HSP 70能提高肿物切除后的荷瘤小鼠生存率,比术后应用IL-2治疗效果明显.     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力. 方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 最后一次免疫完成后4 wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果:MPT64-ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶ 1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17) μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L]. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22). 结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.     

人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达

目的构建人结核杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A,并检测其在体外的表达。方法利用聚合酶链反应（PCR）法及基因重组技术,以人结核杆菌基因组DNA为模板,扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A。将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达。结果经过测序证实重组质粒构建成功,该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA。结论成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A,该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达。     

hIL2-preS融合基因免疫小鼠诱导体液免疫应答

目的 探讨HBV preS基因免疫和hIL-2与preS融合基因免疫诱导BALB／c小鼠体液免疫反应的规律。方法 将preS基因及hIL2-preS融合基因分别克隆入真核表达载体pCMV4,转染COS－7细胞,明确有目的基因表达后,将重组质粒注射BALB／c小鼠臀部肌肉;ELISA方法检测小鼠血清抗体。结果 pCMV4-preS接种组,3／7小鼠产生抗preS2抗体。pCMV4-hIL2-preS接种组有3／7小鼠产生抗hIL-2抗体,而未检测到抗preS2抗体。结论 pCMV4-preS可有效诱导小鼠产生抗体反应。hIL2-preS融合基因接种BALB／c小鼠时,可诱导产生抗hIL-2抗体。     

沙眼衣原体T细胞表位融合蛋白对小鼠生殖道沙眼衣原体感染的保护作用

目的：评价抗沙眼衣原体(Ct）感染的T细胞表位融合蛋白疫苗（H-ctm1）对小鼠生殖道感染的保护作用。方法：6～8周龄雌性C57BL/6小鼠分为3组：H-ctm1、热灭活Ct（HK-EBs）和磷酸盐缓冲液（PBS）免疫组（每组28只，其中9只用于衣原体感染包涵体数量的检测，10只用于组织病理学观察，9只用于输卵管积水情况分析）。3组分别用H-ctm1、HK-EBs和PBS免疫。通过阴道接种Ct感染小鼠，建立Ct感染小鼠生殖道的动物模型。接种前7 d皮下注射黄体酮以增加小鼠对Ct感染的敏感性。并通过该动物模型比较3组小鼠阴道分泌物中的Ct数量、阴道组织炎症病理积分及输卵管积水情况，评价H-ctm1抗沙眼衣原体感染的能力。结果：在阴道接种Ct后第3和6天，H-ctm1和HK-EBs两免疫组小鼠阴道分泌物中Ct数量比较差异均无显著性，但两组均明显少于PBS免疫组（P＜0.01）；在接种Ct后第9和18天，H-ctm1组小鼠阴道分泌物中Ct数量明显少于HK-EBs组（P＜0.01或P＜0.05）。在接种Ct后第6天，H-ctm1和HK-EBs组的炎症积分均明显低于PBS组（P＜0.01或P＜0.05）；在感染Ct后第12天， H-ctm1组的炎症积分明显低于HK-EBs组和PBS组（P＜0.05或P＜0.01）。在感染Ct后第40天，H-ctm1 和HK-EB_S组小鼠均未发生输卵管积水，而PBS组9只小鼠均发生单侧或双侧输卵管积水。结论：注射H-ctm1诱导小鼠产生较好的抗Ct感染的保护性免疫，且H-ctm1的免疫原性优于Ct灭活疫苗。     

Efficacy of Gold Nanoparticles against Nephrotoxicity Induced by Schistosoma mansoni Infection in Mice

Objective In this study, the ameliorative effects of gold nanoparticles(gold NP) on the renal tissue damage in Schistosoma mansoni(S. mansoni)-infected mice was investigated. Methods High-resolution transmission electron microscopy was used for the characterization of NP. The gold NP at concentrations of 250, 500, and 1000 μg/kg body weight were inoculated into S. mansoni-infected mice. Results The parasite caused alterations in the histological architecture. Furthermore, it induced a significant reduction in the renal glutathione levels; however, the levels of nitric oxide and malondialdehyde were significantly elevated. The parasite also managed to downregulate KIM-1, NGAL, MCP-1, and TGF-β mR NA expression in infected animals. Notably, gold NP treatment in mice reduced the extent of histological impairment and renal oxidative damage. Gold NP were able to regulate gene expression impaired by S. Mansoni infection. Conclusion The curative effect of gold NP against renal toxicity in S. mansoni-infected mice is associated with their role as free radical scavengers.     

Toll样受体在介导结核分枝杆菌感染免疫反应中的作用

结核分枝杆菌是结核病的致病菌,机体免疫反应在结核菌的防御和致病中发挥关键调控作用。模式识别受体家族中的Toll样受体(TLRs)能感知结核杆菌感染,并参与调控天然免疫和获得性免疫应答;而TLRs亦能介导结核分枝杆菌的免疫逃避机制过程,促进慢性感染的发生、发展。利用免疫佐剂调控TLRs的功能水平可能有助于增强机体抗结核反应,并有望成为结核病预防和治疗的方向。     

Comparative Study on the Immunogenicity between Hsp70 DNA Vaccine and Hsp65 DNA Vaccine in Human Mycobacterium Tuberculosis

There are 3million deaths perannum worldwidedue to tuberculosis,and AIDS is compounding theproblem.A better vaccine than the live mycobacteri-um currently in use,Bacillus Calmette- Guerin( BCG) ,is needed.Mycobacterium heat shock pro-tein ( HSP) can not only enhance the immune re-sponse,but also keep the antigen characteristics ofmycobacterium itself.Our cooperator,Silva fromLowrie group of British National Medical Academy,cloned the mycobacterium Hsp65 gene into a eukary-otic expressi…     

Evaluation of the Protective Efficacy of a Fused OmpK/Omp22 Protein Vaccine Candidate against Acinetobacter baumannii Infection in Mice

正Acinetobacter baumannii(A.Baumannii)is an emerging opportunistic pathogen responsible for hospital-acquired infections,and which now constitutes a sufficiently serious threat to public health to necessitate the development of an effective vaccine.In this study,a recombinant fused protein named Omp K/Omp22 and two individual proteins Omp K and Omp22 were obtained using recombinant expression and Ni-affinity purification.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target,ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP10）的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

表达HIV-1 B亚型gp160的腺病毒载体疫苗的质量研究和药效学研究

目的:系统评价本实验室表达HIV-1B亚型gp160的腺病毒载体疫苗(Ad5-HIV gp160)在小鼠体内的免疫效果。为之后进行的恒河猴药效学提供研究基础,为申报Ⅰ期临床试验提供资料支持和质量检定方法。方法:Ad5-HIV gp160以不同剂量分别免疫小鼠,采用ELISPOT法和ELISA法检测免疫小鼠体内特异性细胞免疫反应和体液免疫反应。结果:各剂量组小鼠均可诱导出较高水平的细胞免疫反应和体液免疫反应。结论:疫苗的质量研究显示基因插入表达正常,Ad5-HIV gp160疫苗剂量为2×108 VP/只时能够在小鼠体内激发出高水平的细胞免疫反应和体液免疫反应。     

小鼠侧脑室注射卡介苗诱导NMO-IgG/AQP4抗体的表达

【目的】 通过小鼠侧脑室注射卡介苗(BCG)致中枢神经系统结核分枝杆菌(MTB)感染,检测小鼠血清中是否有视神经脊髓炎(NMO)-IgG/水通道蛋白4(AQP4)-Ab的表达? 【方法】 雌性C57BL/6J小鼠40只,6 ~ 8周,随机分为4组:5 × 106 CFU BCG组?1 × 106 CFU BCG组?0.01 mol/L PBS组?正常组?右侧侧脑室注射,注射后1周脑室注射追加1次?小鼠BCG注射后第7?14?21?28天,分别取血并检测血清中NMO-IgG/AQP4-Ab?注射后第28天处死小鼠行抗酸杆菌培养,并对脑和脊髓进行HE?抗酸?LFB髓鞘染色,免疫组化检测病灶处AQP4?GFAP的表达及C5b9沉积情况?【结果】 脑室注射后,BCG组小鼠行为活动降低,出现肢体瘫痪,甚至死亡,其中5 × 106 CFU BCG组表现严重,死亡率高?注射卡介苗21 d时小鼠血清检测发现5 × 106 CFU BCG组中2 只小鼠血清NMO-IgG/AQP4-Ab阳性,1 × 106 CFU BCG组中4只小鼠血清中抗体阳性?第28天时5 × 106 CFU BCG组的两只血清阳性的小鼠死亡,1 × 106 CFU BCG组中原抗体阳性的小鼠血清中抗体仍为阳性?病理检测显示脑和脊髓出现炎性细胞浸润,病灶处抗酸染色阳性,出现脱髓鞘改变?组织培养3周后可见MTB生长,免疫组化显示病灶区域AQP4?GFAP表达降低,部分炎性细胞及血管周围出现补体C5b9沉积?【结论】 中枢神经系统MTB直接感染可诱导产生NMO-IgG/AQP4-Ab?     

结核分枝杆菌抗原Ag85B优势诱导活动性结核患者Th1型细胞免疫反应研究

目的 观察Ag85B抗原在诱导活动性结核患者细胞免疫应答中的作用.方法 选取60例活动性结核患者,分离其外周血单个核淋巴细胞(PBMC),加Ag85B抗原刺激培养72h,ELISA法检测上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10细胞因子浓度,流式细胞术(FCM)检测CD4⁺T淋巴细胞内的细胞因子IFN-γ水平,定量PCR及Western blot法检测PBMC细胞转录因子T-bet、GATA-3的表达.结果 检测活动性结核患者外周血单个核淋巴细胞(PBMC)培养上清液,Ag85B蛋白实验组Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2浓度明显高于结核菌素(PPD)组(P<0.05),而Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平与PPD组相比,差异无统计学意义(P>0.05),以上两组细胞因子水平均明显高于空白对照组(P<0.05).流式细胞法检测CD4⁺T胞内细胞因子IFN-γ水平,Ag85B蛋白实验组高于PPD组及空白对照组(P<0.05).定量PCR及Western blot法检测,T-bet水平Ag85B组高于PPD组(P<0.05),而GATA-3水平差异无统计学意义(P>0.05).结论 结核杆菌抗原Ag85B可以通过上调Th1型转录因子T-bet诱导优势Th1型免疫反应,为结核病的预防及治疗提供理论基础.     

不同佐剂的弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答

目的比较IFN-γ、蜂胶佐剂以及两种佐剂混合鼻内免疫辅助可溶性速殖子抗原(STAg)增强机体黏膜免疫应答的水平,探讨两种佐剂联合应用的免疫效果。方法将5～6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4组(各15只):20μgSTAg,20μgSTAg 40μg蜂胶,20μgSTAg 1000UIFN-γ或20μgSTAg 40μg蜂胶 1000UIFN-,γ均溶于总体积为20lμ的PBS中,滴鼻免疫(10lμ/鼻孔),免疫2次,间隔14d。末次免疫后第10天用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。攻击后第43天处死全部存活小鼠,比较各组小鼠肠黏膜小肠上皮内淋巴细胞(IEL)、PP结T淋巴细胞数;检测小鼠粪便、鼻咽冲洗液、肺冲洗液、阴道冲洗液中弓形虫特异性sIgA含量。结果各佐剂组小鼠IEL、PP结T淋巴细胞数显著高于STAg组,黏膜sIgA含量显著高于STAg组;蜂胶 IFN-γ联合组小鼠黏膜免疫应答水平高于单独佐剂组,其中显著高于蜂胶组(P<0.05)。结论IFN-γ作为弓形虫黏膜疫苗佐剂的效应优于蜂胶,IFN-γ 蜂胶作为复合黏膜佐剂鼻内免疫效果优于两者单独应用。     

不同载体的日本血吸虫DNA疫苗诱导小鼠免疫效果的观察

目的　观察不同真核表达载体的日本血吸虫 DNA疫苗的免疫效果 ,筛选合适的血吸虫 DNA疫苗。方法　将小鼠分成 5组 ,于第 0、 3、 5周将日本血吸虫真核表达载体 p BK- Sj2 3 ,p BK- Sj2 6以及 p CD- Sj2 3 ,p CD- Sj2 6,分别接种小鼠股四头肌 ,第 9周每组小鼠以 40± 2条血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击感染 6周后 ,剖杀小鼠 ,计算减虫率和减卵率 ,比较含血吸虫同一抗原分子的不同载体诱导小鼠的抗攻击感染能力。结果　发现疫苗 p CD- Sj2 3和 p CD- Sj2 6诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为 3 0 .5 0 %和 3 3 .0 2 % ;疫苗 p BK- Sj2 3和 p BK- Sj2 6诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为 18.2 4%和 2 1.70 % ,含血吸虫同一抗原分子的不同载体诱导小鼠的抗攻击感染能力具有显著性差异。结论　由真核表达载体p CD构建的血吸虫 DNA疫苗比由真核表达载体 p BK构建的血吸虫 DNA疫苗具有更好的抗血吸虫感染的能力