差速离心法提取血小板来源的外泌体及其鉴定

目的 探究影响血小板来源外泌体的提取与鉴定的因素.方法 该次于2020年6—9月期间,方便选取实验样本100份展开研究,采用差速离心法进行分离提取,采用透射电镜、Western Blotting验证提取产物;使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定外秘体总蛋白浓度.结果 差速离心法可获得血小板源外泌体,存放3d的血小板源外泌体...     

巨噬细胞来源外泌体的分离与鉴定

目的 分离并鉴定巨噬细胞来源的外泌体,为当前外泌体的提取研究提供一定参考,并为后续开展外泌体与牙周组织再生的相关研究奠定基础.方法 体外培养巨噬细胞RAW264.7,使用超速离心和超滤结合法提取其外泌体,通过BCA试剂盒测定外泌体的蛋白总量,透射电镜下观察其形态特征,粒径分析仪测定其粒径大小及浓度,免疫印迹法检测外泌体...     

鼻咽癌细胞来源外泌体的提取和鉴定

目的：从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1中分离外泌体,并对CNE－2所得外泌体进行鉴定。方法使用ExoQuick－TC（ SBI）试剂盒法从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜观察其形态特征,BCA法进行蛋白定量,Western blot进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白－1鉴定。结果3种鼻咽癌细胞系培养上清液中均分离出大量泡状物,透射电镜下观察呈圆形的囊泡,直径为40～130 nm,具有完整胞膜。且CNE－2来源的此种泡状物表达外泌体特异性膜筏蛋白－1、CD63。10 mL对数生长期CNE－2培养上清液得到487μg／mL（以蛋白计）的外泌体200μL。结论本实验室保存的3种鼻咽癌细胞系很可能均能产生外泌体,ExoQuick－TC（ SBI）法能够简便快速地从鼻咽癌细胞系中提取到外泌体,不需要超速离心,为鼻咽癌的防治研究提供了新的研究方法和靶点。     

缺氧诱导巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的 分析缺氧诱导巨噬细胞分泌产生外泌体,并对外泌体的形态特征进行分析鉴定。方法 首先采用佛波酯诱导THP-1细胞促使其分化成为巨噬细胞,分别收集缺氧干预0,12,24 h的巨噬细胞源性外泌体,通过BCA方法提取外泌体蛋白,使用Western blot方法测定分析外泌体阴性对照蛋白Histone和外泌体表面标志蛋白CD63和HSP70的表达。利用透射电子显微镜及Nanosight NS300仪分析外泌体的形态、特征及粒径大小。结果 与缺氧干预0 h及12 h相比,缺氧干预24 h所得的巨噬细胞源性外泌体蛋白含量、CD63及HSP70的表达升高(P<0.05),而三组外泌体中均未检出Histone蛋白。外泌体呈形态均一的类圆形,表面有完整的双层模型结构,大多数外泌体颗粒的粒径集中在154 nm左右。结论 成功从缺氧干预巨噬细胞的细胞培养上清液中分离提取出外泌体,通过检测其特异性标志蛋白及形态学分析显示提取的外泌体含量及纯度较高。     

过滤对超速离心法提取外泌体的影响

目的 明确过滤对超速离心法提取外泌体数量及纯度的影响,为当前外泌体的提取方法提供一定参考。方法 收集健康人血浆和肺癌PC-9/IR细胞培养上清,分为未过滤组(unfiltration group,NC) 和过滤组(filtration group,GL),过滤组采用0.22 μm 过滤器过滤。超速离心法提取外泌体,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测过滤前后纳米颗粒(外泌体)数量及粒径大小变化,Aminis成像流式检测过滤前后CD9⁺外泌体(CD9⁺ exosomes,CD9⁺Exo)和CD63⁺外泌体(CD63⁺ exosomes,CD63⁺Exo)数量及百分比。结果 NTA结果显示,与NC组相比,血浆过滤后外泌体数量下降4.7倍,培养上清过滤后外泌体数量下降2.5倍。Aminis成像流式结果显示,血浆中CD9⁺Exo和CD63⁺Exo的数量过滤后分别下降了5倍和2.6倍,培养上清中CD9⁺Exo和CD63⁺Exo的数量过滤后分别下降了3倍和2.3倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,Aminis成像流式结果显示,过滤后颗粒中CD9⁺Exo和CD63⁺Exo的百分比没有提高,差异无统计学意义。结论 过滤降低了超速离心法提取外泌体的数量,并未提高外泌体的纯度。     

非小细胞肺癌源性外泌体提取方法探讨

目的:比较3种提取非小细胞肺癌A549细胞培养上清中外泌体 (Exosomes) 的方法,为获得高质量的Exosomes提供参考?方法:分别采取超速离心法?进口ExoQuick-TC提取法?国产Ribo提取法提取A549细胞培养上清中的Exosomes?利用透射电镜进行形态学观察,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠法进行蛋白定量,Western blot检测Exosomes表面标志物 CD63表达?结果:3种方法均可提取到Exosomes,电镜下可观察到圆形膜性囊泡结构?进口ExoQuick-TC提取法及国产Ribo提取法提取样本浓度显著高于超速离心法(P < 0.05);3种方法提取样本均有Exosomes特异性标志蛋白 CD63表达,超速离心法CD63表达最高?结论:超速离心法?进口ExoQuick-TC提取法?国产Ribo提取法均可成功分离Exosomes,超速离心法获得的Exosomes纯度较高,应用试剂盒方法获得的Exosomes浓度高?     

人皮肤表皮干细胞外泌体的分离培养与鉴定

目的 通过优化技术流程,探究人皮肤表皮干细胞(EPSCs)体外分离培养及表皮干细胞外泌体(EPSCs-Exo)分离纯化的方法。方法 首先通过优化人源EPSCs的分离酶,运用改良的无血清培养液,添加10种因子刺激EPSCs生长,促进其分泌EPSCs-Exo,同时维持EPSCs干性和增殖性,延缓EPSCs的分化和成熟。进一步优化差速离心的条件,高效高纯度提取人源的EPSCs-Exo。对人皮肤组织进行免疫荧光染色溯源EPSCs;对分离的EPSCs进行Western blot和免疫荧光染色检测其表面多个标志物;对EPSCs-Exo从形态、粒径大小、多个胞内和膜上标志物进行鉴定。结果 人皮肤组织分层表达表皮细胞的标志物,EPSCs高表达整合素α6(integrin-α6)、整合素β1(integrin-β1)、P63蛋白(P63)、细胞角蛋白19(CK19)等标志物,EPSCs上清液超速离心后的透射电镜显示茶托状结构,粒径大小检测直径介于30～150 nm,蛋白印迹显示Tsg101、CD9、CD63(溶酶体相关膜蛋白3)呈阳性,Calnexin、GAPDH呈阴性。结论 该研究成功在体外分离培养了...     

小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的提取和鉴定方法

目的：建立小鼠胰岛微血管内皮细胞来源的外泌体的提取和鉴定方法,为糖尿病胰岛微血管内皮受损的发病机制研究及重建胰岛微循环完整性的应用提供必要材料。方法选取小鼠胰岛微血管内皮细胞株（MS-1）细胞作为研究对象,取其培养上清液,经多步离心结合蔗糖／D2O垫超速离心方法获取提取物,然后采用透射电镜和Western blotting 法对提取物进行形态和蛋白成分分析,以确定其是否为外泌体。结果提取物呈形态均一的类圆形囊泡,有完整双层膜包绕,内部含有低电子密度物质。囊泡大小约为40～100 nm,可散在分布,也可聚集成团,提取物均阳性表达CD63、CD9和TSG101分子。结论经过形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是MS-1细胞来源的外泌体,便于后续临床和基础研究工作的开展。     

肿瘤来源外泌体调控癌细胞转移机制的研究进展

外泌体在细胞生理、病理过程中发挥重要调控作用,为细胞之间的信号传递搭建了桥梁,而且与癌细胞的远处转移调控密切相关。本文综述了外泌体特征、合成、分泌、成分、功能、生物发生以及肿瘤来源外泌体对肿瘤微环境、肿瘤细胞信号传递以及肿瘤血管生成等各个环节的调控功能及机制,并分析了外泌体在恶性肿瘤转移诊断和治疗方面的潜在价值和应用前景。     

基于PEG6000富集精液来源外泌体的提取及鉴定

目的介绍PEG6000富集精液来源外泌体的提取和鉴定方法,为精液外泌体相关研究奠定基础。方法选自南方医科大学 南方医院检验中心6名正常志愿者精液,经8% PEG6000富集并多步离心结合超速离心方法获取提取物,然后采用透射电子显 微镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析仪分析其大小,蛋白印迹法检测其蛋白组成成分。结果提取物呈类圆形、椭圆形囊泡,质 膜完整,大小约为30~150 nm,内部含有低电子密度物质,均阳性表达CD63、ALIX、TSG101 蛋白,且不含精子细胞内质网 Calnexin蛋白。结论经过对提取物的形态、大小以及其蛋白成分分析证实所提取到的物质为精液来源的外泌体,为后续开展 精液外泌体临床及基础研究提供了方法学基础。     

肿瘤外泌体来源的miR-126-5p通过抑制NLRC3促进口腔鳞癌细胞的增殖和迁移

目的 探索口腔鳞癌外泌体中miR-126-5p对肿瘤细胞生物学功能的影响.方法 qPCR分析口腔鳞癌组织芯片、临床样本及口腔鳞癌外泌体中miR-126-5p的表达情况;荧光素酶报告基因法确定与miR-126-5p相互作用的分子,qPCR检测外泌体与共孵育后的肿瘤细胞中NOD样受体家族蛋白3(NLRC3)的表达情况;通过...     

不同转移习性人鼻咽癌细胞株中外泌体的提取及鉴定

目的 探索不同转移习性人鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞外泌体的表达情况,为进一步研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供一定的理论基础。 方法 在2018年5月—2019年6月期间,用Exosome提取试剂盒从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜进行观察验证外泌体形态,BCA试剂盒测定外泌体蛋白的浓度,蛋白质印迹法(Western blotting)法进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1的检测。 结果 3种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞上清液中均分离出泡状物,在透射电镜下呈椭圆形或者圆形的泡状物。SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞系外泌体蛋白浓度分别为0.778、0.635、0.788、0.576μg/μL;且所有细胞系来源的外泌体经检测均表达特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1。 结论 3种鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞均产生外泌体。      

多步离心法提取K526细胞外泌体

目的:探讨多步离心提取K526细胞外泌体的实验方法.方法:选用白血病细胞株K562细胞为研究对象,取其培养上清液,经多步骤离心获取提取物,然后进行形态和蛋白成分分析.结果:形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是K526细胞外泌体.结论:多步离心是一种方便实用的提取外泌体的方法.     

外泌体来源RNA在细胞通讯中的作用

细胞间的通信有多种方式,包括接触式和非接触式。外泌体在细胞通讯中发挥重要作用,其介导的细胞间通信并不需要细胞接触,从而可以产生相对较长距离的影响。外泌体包含RNA成分、mRNA和微小RNA,通过外泌体的双层脂质膜包裹,使得其中的RNA信息可以通过循环系统传递至较远的距离。外泌体的mRNA成分与母细胞的mRNA成分大不相同,而微小RNA的成分却在一定程度上反应母细胞微小RNA的水平。本文综述外泌体在细胞通讯方面的作用,侧重于其携带的RNA。     

主动脉夹层患者尿液来源外泌体不同分离方法的比较

目的 探讨分离主动脉夹层患者尿液来源外泌体的适宜方案。方法 收集主动脉夹层患者尿液,采用超速离心法、透析超滤法和沉淀试剂盒法分离提纯尿液中的外泌体。在生物透射电子显微镜下观察尿液外泌体的形态,用纳米颗粒跟踪分析仪检测其粒径大小、颗粒分布与浓度。结果 经过表征,3种方法获得的尿液外泌体特征如下：（1）超速离心法获得的尿液外泌体具有半杯托状或凹陷的半球形结构;粒径较大,分布较均匀;粒径范围较宽,为（236.4±46.5）nm;浓度较低,为（2.82±0.21）×10¹²个/mL;（2）透析超滤法获得的尿液外泌体形态较好,且数量多;粒径较小,分布较集中;粒径范围较窄,为（128.7±6.3）nm;浓度较大,为（2.16±0.15）×10¹⁴个/mL;（3）沉淀试剂盒法获得的产物在生物透射电子显微镜下未见明显的外泌体结构。结论 主动脉夹层患者采用透析超滤法分离获得的尿液外泌体浓度较高,在对外泌体的纯度要求不是特别高的情况下比较适宜。     

牛奶消化前后外泌体的变化及其对细胞增殖的影响

目的 探究超速离心法获取牛奶外泌体的最适离心力,探讨牛奶外泌体在体外消化模型中的稳定性及消化后的牛奶外泌体对大鼠肠隐窝上皮细胞IEC-6增殖的影响。方法 用体外消化模型消化牛奶,不同离心力超速离心分离牛奶外泌体,用Western印迹法、动态光散射、扫描电镜对消化前后获取的外泌体进行表征,CCK8实验分析外泌体对细胞增殖的影响。结果 牛奶消化后外泌体蛋白浓度明显降低,外泌体标记蛋白CD63和CD9在消化前后的分离产物中均为阳性。消化后的外泌体粒径大于未消化组,且粒径随离心力的升高而降低。扫描电镜下观察,消化前后的牛奶外泌体形态差别不大。用50μg/mL外泌体培养IEC-6细胞,结果显示牛奶消化前后的外泌体均对IEC-6细胞的增殖有促进作用,消化后离心(130000×g)获得的外泌体对细胞增殖的促进作用较为明显。结论 130000×g是获取牛奶外泌体的最适离心力。牛奶消化前后的外泌体在标记蛋白、形态上相似,表明牛奶中的外泌体能耐受体外消化模型的消化,牛奶消化后的外泌体仍能促进IEC-6细胞的增殖。     

远志外泌体样纳米颗粒的分离与成分鉴定

目的 进行远志外泌体样纳米颗粒制备分析,为远志在神经系统疾病防治方面的特殊作用基础提供研究支持。方法 基于超速离心法制备分离远志外泌体样纳米颗粒,经纳米粒度及Zeta电位仪和透射电镜鉴定表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量分布,用HPLC-MS分析鉴定外泌体样纳米颗粒的成分。结果 分离得到的外泌体样纳米颗粒呈茶托状且膜结构明显,平均粒径为153.6 nm,Zeta电位为-9.2 mV;BCA法测得蛋白浓度为1.22 mg/mL,PRELNs蛋白的分子量在10～170 kDa;HPLC-MS鉴定出PRELNs中31个成分。结论PRELNs含有Tenuifoliose A、Onjisaponin B、polygalasaponinⅩⅩⅩⅡ等成分可能是其活性作用的物质基础。     

不同来源外泌体与急性肾损伤的研究进展

外泌体对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用基于其内部含有大量的活性蛋白与核酸分子,外泌体可能是未来治疗肾脏缺血再灌注损伤的最佳选择。了解外泌体内活性蛋白与核酸分子介导的肾脏保护作用及其可能机制具有重要意义。该文就间充质干细胞、内皮祖细胞和肾小管上皮细胞来源的外泌体对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用的研究进行综述,以期为相应器官的缺血再灌注损伤的治疗提供新思路。