地黄内生真菌GG22侵染下miR160家族成员及靶基因的鉴定分析北大核心CSCD

为明确地黄miR160家族成员在响应内生真菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum GG22侵染中的作用,该研究从高通量测序技术获得的小RNA数据库中筛选出地黄miR160家族成员,利用RNAfold分析其前体结构,DNAMAN和MEGA对前体序列和成熟序列进行保守性和进化性分析;对地黄miR160家族成员的靶基因进行预测功能注释以及互作关系分析;结合降解组数据对靶基因进行鉴定分析。结果发现miR160前体具有完整的茎环结构;序列比对显示在前体、成熟序列上都具有较高的保守性,成熟序列中5′端第3~16位碱基高度保守;系统进化树说明了地黄与拟南芥、水稻、丹参及芝麻之间的亲缘关系;预测出22个miR160的靶基因中生长素响应因子(ARF)居多;GO功能分析主要富集到生物学过程、细胞组分以及分子功能;降解组测序获得miR160的4个靶基因注释到ARF18和ARF22;表达特性分析表明,地黄经过内生真菌侵染后,通过改变miR160和靶基因的表达来调控植物生长;对差异表达的rgl-miR160a和rgl-miR160a-3p进行qRT-PCR验证,结果显示与测序结果一致。该研究结果进一步明确了地黄在响应GG22胁迫的分子机制,为地黄今后育种改良以及相关研究提供理论依据。     

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达.方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time P...     

远志bZIP基因家族的鉴定及表达分析

目的 鉴定远志Polygala tenuifolia bZIP基因,为远志抗逆性改良及次生代谢调控研究提供参考。方法 基于远志三代全长转录组数据库,采用生物信息学方法对远志bZIP基因家族成员进行鉴定和分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析其在不同组织及处理中的表达特性。结果 共鉴定得到27个含有特征性保守结构域的PtbZIP基因,编码蛋白质的氨基酸数量为143 aa（PtbZIP24）～846 aa（PtbZIP9）,相对分子质量范围为16201.52～92932.30,等电点（pI）介于4.59～9.69,其中25个家族成员为不稳定蛋白,所有家族成员均为亲水性蛋白。蛋白二级结构主要由α螺旋和无规卷曲构成,均无信号肽,存在多种互作现象。进化树分析将27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个亚组,其中G亚组含有PtbZIP家族成员数量最多（共有8个）,占总数的29.63%,没有PtbZIP基因被归类到E和K组。PtbZIP家族基因的密码子偏好性较弱,适应性较弱。表达模式分析显示,PtbZIP4/15在叶中的表达量最高,茎和根次之;PtbZIP8/24在茎中的表达量最高,叶和根次之;PtbZIP1/17的表达量为根＞叶＞茎;其余21个的表达模式均为根＞茎＞叶。qPCR结果表明,PtbZIP26基因受脱落酸、壳聚糖的诱导,且能显著应答干旱和盐胁迫。结论 鉴定了远志bZIP家族基因及其分子特征,为进一步研究PtbZIP基因在调控远志发育及次生代谢物合成方面的生物学功能奠定基础。     

地黄中响应连作基因的时空表达与分析

目的:前期作者利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了连作地黄的正反消减cDNA文库。该研究从两库中各选5个可能引起地黄连作障碍的基因做时空表达分析,以探讨其在地黄连作障碍中的作用。方法:应用实时荧光定量PCR技术检测这10个基因在正茬、重茬地黄中不同时期不同组织的相对表达量。结果:正库中筛选的5个编码基因(钙依赖性蛋白激酶、SAM合成酶、ACC氧酶、甲基转移酶、钙蛋白酶)在重茬地黄中有较高的表达量,在正茬地黄中几乎无表达;反库中筛选的5个编码基因(RNA依赖的RNA聚合酶、RNA复制酶、依赖于DNA的RNA聚合酶IIa、细胞周期蛋白D、RNA结合蛋白)在正茬地黄中均得到较高表达,而在重茬中却被下调或关闭。结论:参与核心生命过程的关键调控基因(如细胞周期蛋白D、依赖于DNA的RNA聚合酶IIa)在重茬地黄中被抑制或关闭,扰乱了植株正常的基因表达程序,通过钙信号传导和乙烯合成信号,干扰了地黄生长发育的重要代谢过程,从而导致连作地黄植株矮小,发育不良,引起地黄的连作障碍现象。     

地黄饮子改善自发性高血压大鼠进程中血管内皮功能的研究

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)高血压发展进程中,地黄饮子对其血管内皮功能的修复情况及作用机制研究。方法:54只雄性SHR随机分为3组:模型组、地黄饮子组和卡托普利组,7～24周龄ig地黄饮子(生药15.9 g.kg-1.d-1)和卡托普利(3.375 g.kg-1.d-1),停药观察至32周龄。18,24,32周龄时分别颈动脉插管测定大鼠血压值,血管等长张力实验检测离体肠系膜上动脉乙酰胆碱(Ach)依赖性舒张功能;Griess法检测血清NO 2-水平;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测动脉组织白介素-1(IL-1),白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和iNOS mRNA)的表达。结果:地黄饮子降低SHR 18周龄血压,增加18,24周龄肠系膜上动脉Ach依赖性舒张功能和血清NO 2-含量,显著降低动脉组织IL-1,IL-6,TNF-α和iNOSmRNA表达;卡托普利降压作用优于地黄饮子,停药后作用消失,无改善肠系膜上动脉Ach依赖性舒张功能作用,增加血清24周龄NO 2-水平和动脉组织IL-1,IL-6 mRNA表达的同时降低TNF-α和iNOS表达。结论:地黄饮子能显著改善SHR肠系膜上动脉内皮功能,表现为较好的抗高血压作用。该作用可能与其抑制IL-1,IL-6,TNF-α和iNOS表达,改善血管微环境的炎症反应状态有关。     

穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选

目的 筛选合适的穿心莲茉莉酸甲酯（MeJA）和非生物胁迫下实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测的内参基因。方法 利用高温、干旱、紫外和MeJA处理的穿心莲转录组数据,挑选到7个候选内参基因肌动蛋白1（ACT1）,肌动蛋白2（ACT2）,转录延伸因子（EF-1α）,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,微管蛋白（TUB）,多聚泛素酶（UBQ）和18S核糖体RNA（18S）,并以上述处理后的穿心莲叶片为实验材料,进行Real-time PCR验证。利用geNorm,NormFinder 和BestKeeper 3种内参稳定性评估软件进行分析,再利用Refinder软件进行综合分析。结果 3种软件基于不同指标进行稳定性评估,结果并不相同,综合分析得出候选内参基因在高温胁迫下表达稳定性顺序依次为UBQ>18S>EF-1α>ACT2>ACT1>GAPDH>TUB;干旱胁迫下表达稳定性顺序依次为ACT1>UBQ>EF-1α>18S>ACT2>GAPDH>TUB;UV胁迫下表达稳定性顺序依次为EF-1α>TUB>ACT2>UBQ>18S>GAPDH>ACT1;MeJA胁迫下表达稳定性顺序依次为ACT1>EF-1α>UBQ>ACT2>18S>TUB>GAPDH。其中18S基因表达丰度较高,不适合作为内参基因。结合转录组数据对4种胁迫中穿心莲内酯合成相关基因酶羟甲基戊二酰-辅酶A合成酶（HMGS）的相对表达水平验证,发现合适内参基因的Real-time PCR结果更可靠。结论 穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA胁迫时,UBQ,ACT1和UBQ,EF-1α和TUB,ACT1和EF-1α分别为最适内参基因组合,为后期开展穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA处理中基因的功能调控和表达研究提供了参考。     

地黄根部响应涝胁迫关键基因的鉴定

目的:本研究利用RNA-seq技术,对涝胁迫下的地黄根部差异表达基因进行了鉴定,为揭示地黄特异响应涝胁迫的分子机制奠定基础。方法:以温"85-5"怀地黄品种为供试材料,采用人工模拟涝胁迫的方法处理地黄植株,利用升级版数字基因表达谱技术分别对对照及处理样品进行测序,测序结果与转录组文库比对获得表达基因,利用RPKM方法计算基因的表达量,以FDR0.005和|log2 ratio|≥1为标准,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行GO和KEGG注释和富集分析。结果:涝害胁迫处理后共筛选到7249差异表达基因,上调表达2505个(约35%),下调表达4744个(约65%)。结论:KEGGPathway显著性富集分析发现基础代谢、次生代谢、植物激素信号转导途径、淀粉和蔗糖代谢途基因包含的比例较多。功能分析发现,涝害条件下参与乙醇发酵、乙烯合成等途径的基因被显著上调,钙信号途径的基因异常,同时发现许多转录因子呈现差异表达,如WRKY、GRAS和NAC这些与胁迫相关的基因发生上调表达,而调控正常生长的转录因子如BHLH、MYC、BYB、MADS-box等则是以下调表达为主,由此证实涝害胁迫严重影响植物的正常生长发育。     

加减地黄饮子对老年性痴呆模型大鼠Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响

目的观察β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)大鼠海马双侧注射后大脑组织Bax和Bcl-2 mRNA表达的变化及加减地黄饮子的干预作用。方法采用大鼠海马立体定向注射凝聚态Aβ1-40诱导老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)动物模型。采用实时荧光定量PCR法检测大鼠大脑组织Bcl-2和Bax mRNA的表达。结果与假手术组比较,模型组Bax2-ΔΔCt显著升高,而Bcl-22-ΔΔCt显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组、加减地黄饮子组Bax2-ΔΔCt显著降低(P<0.05),而加减地黄饮子组Bcl-22-ΔΔCt显著升高(P<0.05)。结论海马注射Aβ1-40可诱导大鼠脑组织BaxmRNA表达上调和Bcl-2表达下调,而加减地黄饮子可通过抑制海马组织BaxmRNA的表达和促进Bcl-2mRNA表达,进而起到减少神经细胞凋亡的作用。     

15种中药材表面污染真菌的分离与分子鉴定

为了了解中药材受真菌污染的状况,探索中药材表面污染真菌的快速鉴定方法.利用PDA培养基进行中药材污染真菌的分离与纯化.根据真菌基因组ITS序列设计特异引物,通过PCR扩增和序列分析进行菌株鉴定.从15种湖北市售中药材上分离得到50株真菌,污染率为93.3%.利用分子鉴定方法成功鉴定了其中的27株.中药材受真菌污染现象较为普遍,各菌属污染中药材情况不同,其中以曲霉属真菌的污染较严重,存在潜在的风险.该实验所设计的引物通用性较好,可用于中药材表面污染真菌的鉴定.     

盐胁迫蜜环菌Real-time PCR内参microRNA的筛选

目的:在利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)进行microRNA(miRNA)表达分析的过程中,选择合适的内参miRNA对数据标准化起到重要作用。方法:该文挑选了13个蜜环菌候选miRNA对其前体进行生物信息分析,PMRD预测其前体相似序列,并用RNAfold对候选miRNA前体及其相似序列进行二级结构预测。利用Real-time PCR检测在受盐胁迫前后两种基因型蜜环菌(基因型A,基因型B)miRNA的表达量,并结合geNorm,NormFinder,BestKeeper软件分析其表达稳定性,筛选合适的内参。结果:对候选miRNA的9条前体进行二级结构预测以及特征分析,证明预测的miRNA属于miR家族具有典型的茎-环结构且成熟的miRNA位于其前体的5'或是3'端;geNorm分析表明,基因型A蜜环菌可选择Novel-4*,Novel-9作为内参组合,基因型B可选择Novel-9,Novel-16作为内参组合;NormFinder分析结果显示,Novel-9在基因型A蜜环菌和基因型B蜜环菌中都有较好的稳定性;BestKeeper分析显示Novel-12*在基因型A蜜环菌中稳定性较好,Novel-2*在基因型B蜜环菌中稳定性较好。结论:稳定性最优的内参miRNA为Novel-9,为进一步开展蜜环菌miRNA调控机制研究奠定了基础。     

地黄不同品种的RAPD分析

目的 :探讨地黄不同品种 (种质)的遗传多样性和亲缘关系 ,为地黄育种提供依据。方法 :采用 20个10bp随机引物对 19个地黄不同品种的基因组DNA进行RAPD分析。 结果 :共扩增出 163个位点 ,其中多态性位点 114条 ,占 69.9%。根据SPSS 10.0分析软件中的Jaccard相似系数矩阵绘制遗传关系树系图 ,19个地黄品种分为北京系列、855系列、郭里茂等 4个类型。结论 :北京系列的 8个品种首先聚在一起 ,855系列中5个品种较早地聚在一起 ,表明其类内具有较近的亲缘关系。这一关系为地黄的育种材料的选择提供了参考。     

丹参、生地黄中miRNA在人体血液中分离、鉴定及表达分析

目的:通过Northern印迹杂交(Northern blot)验证丹参、生地黄中微小核糖核酸(miRNA)的存在,及水煎服用后通过消化道可进人人体血液中.方法:根据已知丹参、生地黄miRNA序列设计合成10条(丹参4条,地黄6条)特异的LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记.在室温25℃条件下,用通用植物miRNA提取试剂盒和血液(液体样本)miRNA提取试剂盒,并按照试剂盒提供的操作步骤提取新鲜丹参、地黄以及服用丹参、生地黄水煎剂后人体血液的Total RNA,在变性条件下(15％的尿素变性)PAGE电泳分离小RNA,转膜、交联、杂交和检测.结果:Northern blot表明,丹参只有2种miRNA即miR156和miR157表达,生地黄miR5140,miR5139,miR 5138,miR 5137,miR 5142,miR 5141等6种miRNA均有表达.丹参处理组无miRNA表达,生地黄处理组中有miR5140,miR5137,miR5141等3种miRNA表达.结论:验证了丹参、生地黄中miRNA的存在,初步证明了生地黄经水煎后部分miRNA可通过消化道进入人体血液中,为研究miRNA在中药疗效的作用机制提供了新的思路和策略.     

真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及次生代谢产物合成的影响

目的:研究分离自地黄不同部位的内生真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及其次生代谢产物含量的影响,初步探究其促生作用。方法:以2株Alternaria属内生真菌A.alternata,Penicillium属内生真菌P.axalicum制备不同类型的诱导子,发酵液滤液和菌丝降解液,分别考察其对地黄组培苗株高、鲜重、叶绿素含量、梓醇及毛蕊花糖苷含量的影响,并用SPSS 17.0进行数据分析。高效液相色谱法测定梓醇及毛蕊花糖苷含量。结果:不同菌株制备的真菌诱导子促生作用差异明显,以Penicillium属内生真菌P.axalicum制备的真菌诱导子对怀地黄组培苗促生效果较佳,且以其发酵液滤液促生效果最好。在该培养条件下,怀地黄组培苗株高、鲜重、根长、总叶绿素、梓醇及毛蕊花糖苷含量增加率分别为27.80%,29.49%,22.08%,15.05%,35.98%和68.18%。结论:内生真菌诱导子可促进怀地黄组培苗生长,并提高其次生代谢产物含量,在今后地黄内生真菌应用中可做进一步探究。     

地黄HPLC指纹图谱及梓醇含量测定的研究

目的采用HPLC色谱法建立地黄指纹图谱,优化梓醇含量的测定方法,为地黄药材质量标准的提升提供依据。方法选用Atlantis T3-特色硅胶C18色谱柱,流动相为0.1%磷酸水-乙腈,检测波长为203 nm,体积流量1.0 mL/mL,柱温为35℃,梓醇为对照峰,建立20批地黄指纹图谱。采用指纹图谱相似度评价软件进行数据评价,同法测定20批地黄中梓醇的含量。结果所建立的标准对照指纹图谱,20批地黄的相似度均在0.917以上,20批地黄中梓醇质量分数均在0.2%以上。结论建立的地黄HPLC指纹图谱测定方法,重复性、精密度和稳定性良好,梓醇含量测定符合要求,可有效避免《中国药典》2015年版收载方法检测时糖类物质的干扰,为提升地黄药材质量评价水平提供科学参考。     

基于GC-MS代谢组学分析间作玉米下地黄根际土壤中挥发性有机物特征

目的 分析地黄-玉米间作模式下地黄根际土壤挥发性有机物特征,筛选间作玉米下地黄根际土壤中特殊的信号物质,为地黄连作障碍中化感物质的研究提供依据。方法 本实验以7~10月份玉米间作及地黄单作模式下的地黄根际土壤为研究对象,利用气相色谱-质谱法（GC-MS）分析其乙酸乙酯部位中的挥发性有机物,并应用SIMCA 14.1对数据进行主成分分析（PCA）,聚类分析（HCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）处理,筛选2种模式下挥发性有机物中潜在的差异成分。结果 间作及单作模式下地黄根际土壤中的挥发性有机物种类主要为烃类、醇类、酯类、酮类、酰胺类、酸类等物质,其中间作模式下烃类、酯类、酰胺类成分的平均相对质量分数分别为58.46%,32.15%,5.42%,而单作模式下则分别为37.27%,36.11%,21.13%;PCA与HCA分析结果表明间作与单作两种模式下根际土壤乙酸乙酯部位的挥发性有机物特征可以明显地被分为两类;基于OPLS-DA分析的潜在差异成分筛选结果表明,从两种模式下的根际土壤中筛选到邻苯二甲酸二丁酯,（Z）-9-油酸酰胺,间苯二甲酸二辛酯,邻苯二甲酸（2-丙基戊基）二酯,正二十六烷,二十八烷,正二十一烷等差异达到显著水平的几种挥发性有机物。结论 地黄-玉米间作模式对地黄根际土壤中的挥发性有机物有一定的影响,筛选到的几种差异成分对地黄生长及质量特征的影响还有待于进一步研究。     

地黄分子鉴定及功能基因研究进展

地黄是我国常见的大宗药材之一,药用历史悠久。近年来,随着分子生物学技术的进步,尤其是高通量测序技术的出现,不仅为地黄的快速鉴定提供了新方法,也较全面地揭示了其种群的遗传多样性和亲缘关系,更为地黄的活性成分合成代谢调控、块根发育、抗逆响应和连作障碍等机制的研究奠定了分子基础。从系统学研究、分子鉴定、功能基因等方面对近年来地黄分子生物学的研究进展进行了综述,并提出3点研究展望,以期为进一步深入开展地黄的分子研究提供参考。     

HPLC法测定鲜地黄中梓醇和桃叶珊瑚苷

目的 建立HPLC法测定鲜地黄中梓醇及桃叶珊瑚苷的方法,对鲜地黄进行质量控制.方法 采用HPLC法对鲜地黄中梓醇及桃叶珊瑚苷进行定量测定.结果 线性回归方程分别为梓醇Y=43 800X+2 849.2,r=0.999 9;桃叶珊瑚苷Y=76163X+1676.1,r=0.999 9;梓醇和桃叶珊瑚苷线性范围分别为0.19～2.375μg、0.152～1.90μg,回收率分别为99.00%和99.38%.结论 该方法准确、重现性好,可以作为鲜地黄的质量控制方法.     

地黄中介体亚基基因RgMed6的分离与表达特性

目的克隆地黄中介体亚基基因Rg Med6,分析其编码的蛋白序列特征和基因表达特性。方法利用地黄转录组数据库进行同源比对,获得拟南芥Med6的同源基因片段,通过序列拼接获得RgM ed6的全长开放阅读框(ORF),在NCBI上进行BLASTp获得RgM ed6的同源蛋白,用MAFFT进行多序列联配,应用MEGA 6.0构建系统进化树,以实时荧光定量PCR技术检测Rg Med6在地黄不同组织以及逆境胁迫下的相对表达量。结果获得1条924 bp的c DNA序列,包含1个771bp的完整ORF,编码256个氨基酸,具有Med6蛋白的典型结构域和1个潜在的核定位信号序列。Rg Med6在检测的5个地黄组织(器官)中均有表达,其中在地黄叶片里表达强度最大,其次为花蕾,在茎中表达量最低。在连作地黄块根中RgM ed6的表达量降低,Na Cl胁迫处理下Rg Med6的表达量升高。结论首次克隆了地黄中介体亚基基因Rg Med6,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

基于UPLC-TQ-MS的地黄中核苷类和氨基酸类成分动态积累研究

目的 分析评价地黄Rehmannia glutinosa根与叶中5种核苷与14种氨基酸类成分,揭示其动态积累规律,为其合理利用提供科学依据。方法 选取不同生长期的地黄根和叶以及不同产地（河南大封、河南温县、河南南召）的地黄叶为研究对象,采用超高效液相色谱-三重四极质谱联用技术（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-TQ-MS）分析不同生长期地黄根和叶以及不同产地地黄叶中核苷类与氨基酸类成分的动态变化。结果 研究发现地黄根及地黄叶中均含有5种核苷类成分和14种氨基酸类成分,2部位中不同生长期2类成分的总含量分别为3.88～16.97 mg/g和4.27～25.32 mg/g;地黄根和叶中测得的2类成分总量分别在10月中下旬和11月上中旬显著升高,达到各自峰值,其中L-谷氨酰胺与L-赖氨酸含量最高,占总含量的60%以上;大部分生长期地黄叶中核苷类和氨基酸类成分较地黄根高,尤其在10月下旬;不同产地地黄叶中以河南南召产者核苷和氨基酸含量较高,总含量最高可达30.756 mg/g。结论 阐明了地黄中核苷类和氨基酸类成分的分布和动态积累过程,为地黄药食两用特性及合理采收期提供了科学依据,提出了地黄叶可作为新的食用新资源为机体补充核苷类和氨基酸类成分的建议,为地黄叶资源价值的发现、开发和利用提供了支撑。     

不同品种地黄中毛蕊花糖苷的动态积累规律变化

目的:对大田生长期间不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量进行测定,研究道地产区不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷的积累规律。方法:以栽培地黄85-5,北京1号,沁怀,金九和白选为材料,于2015年和2016年在河南温县大田栽培,以HPLC检测不同采收期不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷的含量。并以85-5为材料,于2014年进行遮阴处理,以HPLC检测遮阴后地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量。结果:不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷含量有较大差异,块根中毛蕊花糖苷含量较高的2个品种是白选和沁怀,两年内毛蕊花糖苷含量变化分别为0.023%~0.620%和0.018%~0.796%;叶片中毛蕊花糖苷含量较高的品种为85-5和北京1号,毛蕊花糖苷含量变化分别为1.955%~5.968%和0.681%~5.941%。不同发育阶段的地黄叶片中,展开叶和衰老叶较幼嫩叶含有较高的毛蕊花糖苷。遮阴对地黄块根中毛蕊花糖苷含量有促进作用,对叶片中毛蕊花糖苷含量有抑制效应。结论:该研究为毛蕊花糖苷高含量地黄新品种的选育提供实验材料和依据,同时也为明确地黄毛蕊花糖苷积累变化的分子机制奠定基础。