红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系。方法通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的红景天苷培养液。后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组。RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡。结果与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低。红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡。     

白细胞介素6促胆囊癌细胞增殖、侵袭与JAK/STAT3信号通路的关系

目的:探讨炎症因子白细胞介素6(IL-6)对胆囊癌细胞生物学行为的影响及其与JAK/STAT3信号通路的关系.方法:将胆囊癌细胞株GBC-SD用IL-6或IL-6+AG490(JAK/STAT3通路抑制剂)作用后,分别用MTT法检测增殖情况;Transwell法检测侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性;Western blot法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果:IL-6(10,50,100 ng/mL)作用后,GBC-SD细胞增殖呈浓度依赖性增加(均P＜0.05),AG490能取消IL-6对细胞增殖的促进作用.IL-6作用GBC-SD细胞后,细胞侵袭能力及MMP-9的分泌明显增加(均P＜0.05),细胞p-STAT3和VEGF的表达明显上调,加入AG490后,以上作用均被取消.结论:IL-6能促进胆囊癌细胞的增殖通和侵袭,其作用可能与其活化JAK/STAT3信号通路,从而上调下游的MMP-9和VEGF的表达有关.     

JAK激酶抑制剂AG490联合5-氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞STAT3信号转导通路的研究

目的 探讨STAT3信号转导通路在药物治疗结肠癌中的作用机制。方法 应用JAK激酶抑制剂AG490与5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理结肠癌细胞HCTll6，Western blot检测JAK2／STAT3信号转导通路成员表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果 AG490与5-Fu可以抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡，联合应用AG490与5-Fu可以起协同作用，结肠癌细胞STAT3信号转导通路成员表达与活性明显下降。结论．IAK激酶抑制剂AG490与5-Fu联合应用可能为治疗结肠癌提供了新的理论基础。     

促红细胞生成素对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用研究

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保护作用及机制。方法将30只雄性SD大鼠随机均分成假手术组、模型组和EPO组,每组10只。EPO组在术前1h给予腹腔注射促红细胞生成素(1 000U/kg),假手术组和模型组则给予等体积生理盐水腹腔注射。EPO组和模型组夹闭左侧肾蒂45min,去除右肾,再灌注24h构建大鼠肾脏IRI模型;假手术组操作同上,但不夹闭左侧肾蒂。恢复肾脏血流灌注24h后收集大鼠肾脏和血清。采用酶联接免疫吸附剂检测血肌酐(SCr),尿素氮(BUN)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、干扰素(inteferon gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors-α,TNF-α)以及抗炎细胞因子白介素10(IL-10)和转化细胞生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达;逆转录聚合酶链反应检测肾脏IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的mRNA水平;免疫蛋白印记法检测促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EPOR)、磷酸化促红细胞生成素受体(pEPOR)、酪氨酸激酶-2(JAK2)、信号转导及转录激活子3(STAT3)、磷酸化酪氨酸激酶-2(p-JAK2)、磷酸化信号转导及转录激活子3(p-STAT3)表达水平;过雪夫染色检测肾组织病理形态。结果与假手术组相比,模型组p-EPOR、p-JAK2、p-STAT3、SCr、BUN、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平以及肾组织病理改变均明显增加,而IL-10和TGF-β表达明显减少以及EPOR、JAK2和STAT3表达无差异;与模型组相比,EPO组p-EPOR、p-JAK2、p-STAT3、IL-10和TGF-β表达增加,而SCr、BUN、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平以及肾组织病理改变明显减少,而EPOR、JAK2和STAT3表达依然无差异。结论 EPO预处理可通过抑制炎症减轻肾脏IRI,其作用机制与进一步促进EPOR/JAK2/STAT3信号途径活化相关。     

AG490预先给药对脓毒血症大鼠血清和肾组织肿瘤坏死因子-α水平的影响

脓毒血症及其所引起的多器官功能障碍综合征(MODS) 是严重烧伤、感染、休克等危重病人死亡的主要原因之一。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种强烈的促炎细胞因子,在脓毒血症的发生和发展以及全身炎症反应综合征(SIRS)中发挥着核心而关键性作用。TNF-α抗体治疗脓毒血症虽然在动物实验中取得不错的效果,但在临床试验中并未取得预期效果。细胞信号通路参与介导了脓毒血症炎症介质的表达。JAK/STAT信号通路与脓毒血症的发生发展有关。体外实验发现JAK/STAT信号通路对TNF-α的产生发挥着一定的调节作用。抑制JAK/STAT信号通路的活化可减轻脓毒血症大鼠肾组织损伤,改善肾功能。但通过干预JAK/STAT 途径而调节TNF-α水平的体内实验尚需进一步探讨,本研究拟观察JAK抑制剂AG490对脓毒血症大鼠肾组织和血清TNF-α水平的影响。     

细胞因子信号转导抑制因子3抑制血小板衍生生长因子-BB诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的作用及其机制

目的 探讨细胞因子信号转导抑制因子3( SOCS3)抑制血管平滑肌细胞炎症反应的作用及机制.方法 用携带大鼠SOCS3基因的腺病毒(pYrAd-rSOCS3)转染血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激的大鼠动脉血管平滑肌细胞.实时定量聚合酶链反应(Real time-PCR)检测SOCS3、白细胞介素(IL) -1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达.Western blot检测SOCS3、信号转导及转录激活因子3(STAT3)、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1的的蛋白表达.结果 PDGF-BB刺激血管平滑肌细胞24h后,SOCS3、STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1表达均上调;pYrAd-rSOCS3转染血管平滑肌细胞后再用PDGF-BB刺激,其SOCS3表达进一步上调,但STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1表达明显下调.结论 上调血管平滑肌细胞SOCS3表达通过负反馈调节酪氨酸蛋白激酶(JAK) -STAT3信号通路,抑制STAT3的激活及磷酸化而下调炎性细胞因子表达.     

辣椒素减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤的作用

目的探讨辣椒素减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的作用及其机制。方法成年健康清洁雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为四组:假手术组(S组)、缺血-再灌注组(IR组)、辣椒素组(CAP组)和辣椒素+辣椒平组(CPZ组),每组10只。S组仅分离双侧肾蒂不结扎,IR组、CAP组和CPZ组通过动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min,再灌注24 h的方法建立肾缺血-再灌注模型。S组与IR组在同时点注射等容量生理盐水,CAP组和CPZ组大鼠于缺血前30 min经腹腔注射辣椒素30 mg/kg。CPZ组大鼠于缺血前45 min经腹腔注射辣椒平20 mg/kg。于再灌注24 h后取血标本检测大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)浓度。采用Western blot法检测Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导子及转录激活子3(STAT3)、磷酸化Janus蛋白酪氨酸激酶2(P-JAK2)、磷酸化信号转导子及转录激活子3(P-STAT3)和caspase-3的蛋白含量。取肾组织观察组织病理学改变,检测凋亡率(AI)。结果与S组比较,IR组、CAP组和CPZ组血清Cr、BUN、IL-6、TNF-α、IL-10浓度、P-JAK2/JAK2、P-STAT3/STAT3和caspase-3蛋白含量明显升高(P0.05),肾小管上皮细胞出现不同程度的肿胀,空泡变性,刷状缘脱落,部分肾小管管腔扩张,肾小管损伤评分和AI明显升高(P0.05);与IR组和CPZ组比较,CAP组血清Cr、BUN、IL-6、TNF-α浓度、P-JAK2/JAK2、P-STAT3/STAT3和caspase-3含量明显降低(P0.05),肾小管损伤减轻,肾小管损伤评分和AI明显降低(P0.05),IL-10浓度明显升高(P0.05)。结论辣椒素可减轻缺血-再灌注引起的大鼠肾组织损伤,其机制可能与抑制IL-6/JAK2/STAT3通路,抑制炎症反应,减少细胞凋亡和组织损伤有关。     

JAK2/STAT3信号通路在川芎嗪减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

目的 评价Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在川芎嗪减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用.方法 健康成年雄性Wistar大鼠64只,体重250～300 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为4组(n＝ 16):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、川芎嗪组(T组)和JAK2特异性抑制剂AG490组(AG组).采用结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型.S组开胸暴露心脏,左冠状动脉前降支仅穿线;T组于阻断左冠状动脉前降支前20 min静脉注射川芎嗪20 mg/kg; AG组于阻断左冠状动脉前降支前20min静脉注射川芎嗪20 mg/kg,再灌注前5min静脉注射AG490 3 μg/g.再灌注l20 nin时,取下腔静脉血样,测定血清肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)的活性;观察心肌超微结构,计算心肌梗死体积百分比.结果 与S组比较,I/R组、T组和AG组血清CK和LDH的活性升高(P<0.01);与I/R组比较,T组血清CK、LDH活性和心肌梗死体积百分比降低,AG组血清CK、LDH活性降低(P<0.01);与T组比较,AG组血清CK、LDH活性和心肌梗死体积百分比升高(P<0.05).T组心肌病理学损伤较I/R组和AG组减轻.结论 JAK2/STAT3信号通路参与了川芎嗪减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用.     

JAK2/STAT3通路参与过氧化氢抑制小鼠原代颗粒细胞增殖的研究

目的通过过氧化氢(H2O2)处理体外培养的小鼠原代颗粒细胞(mGC),探讨JAK2/STAT3信号通路在H2O2抑制mGC增殖中的作用。方法应用H2O2、JAK2抑制剂AG490(不同浓度、不同作用时间)处理mGC;用CCK-8、增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)水平检测细胞增殖情况,RT-PCR检测JAK2mRNA水平,Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1的蛋白表达水平。结果 H2O2与AG490均以剂量和时间依赖方式降低mGC活率。750μmol/L的H2O2处理mGC 24h明显降低细胞活率(P0.01),降低PCNA蛋白水平(P0.01),并下调JAK2mRNA和蛋白表达水平(P0.01);80μmol/L的JAK2抑制剂AG490可降低细胞活率(P0.01),且使细胞中的p-JAK2、JAK2、STAT3、p-STAT3、PCNA、Cyclin D1表达均下降(P0.05)。结论 H2O2抑制mGC增殖可能与JAK2/STAT3信号通路有关。     

H3K4m3和H3K9m3修饰对胰岛组织特异性基因表达的影响

目的 通过比较不同细胞类型之间胰腺十二指肠同源盒1(Pdx-1)、配对盒基因4(Pax4)、MafA(mast cell function associated antigen)和Nkx6.1等胰岛组织特异性基因其转录起始区的H3K4m3和H3K9m3修饰的差异,探讨H3K4m3和H3K9m3修饰对胰岛组织特异性基因表达的作用.方法 采用染色质免疫共沉淀一实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测小鼠胚胎干细胞(mES,1×10~7)、小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞(1×10~7)和小鼠β细胞株NIT-1细胞(1×10~7)三者中的胰岛组织特异性基因、Oct4基因和MLH1基因转录起始区H3K4m3和H3K9m3修饰的状况.同时采用实时定量逆转录(RT)-PCR检测上述3种细胞各基因mRNA表达水平.分析H3K4m3和H3K9m3修饰改变与基因表达之间的关系.结果 NIT-1细胞中Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1等胰岛组织特异性基因转录起始区的H3K4m的修饰水平分别为:(4.84±0.05)%、(9.91±1.33)%、(10.64±0.87)%、(0.23±0.03)%,与mES细胞比较明显增高(P<0.05),基因表达;NIH3T3细胞中Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1等胰岛组织特异性基因转录起始区的H3K9m3的修饰水平分别为:(0.64±0.21)%、(7.04±1.29)%、(0.39±0.10)%、(2.35±0.81)%,与mES细胞比较明显增高(P<0.05),基因不表达.结论 H3K4m3与H3K9m3修饰能相互协调,共同调控胰岛组织特异性基因的表达.     

蓝舌病毒湖北株对人前列腺癌PC-3细胞杀伤效应的研究

目的体外实验研究蓝舌病毒湖北株3（BTV-HbC3）对人前列腺癌PC-3细胞的杀伤效应并且初步探讨BTV-HbC3靶向性溶瘤的机制。方法观察PC-3细胞感染BTV-HbC3后所致的病变效应（CPE）变化;透射电镜观察细胞感染病毒后超微结构的变化;CCK-8法研究病毒致细胞病变效应的特征;DNA Ladder分析病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪检测病毒对PC-3细胞凋亡的影响。结果 BTV-HbC3感染PC-3细胞后可见到明显的细胞效应;透射电镜发现胞浆内有大量病毒颗粒和典型细胞凋亡的形态变化;CCK-8法检测到病毒明显抑制细胞生长;DNA Ladder分析见阶梯状条带;流式细胞仪检测到明显细胞凋亡的存在,可见明显的亚二倍体峰。结论 BTV-HbC3在体外可有效地杀伤PC-3细胞,并能诱导其凋亡。     

Microcarriers facilitate mineralization in MC3T3-E1 cells

Summary MC3T3-E1 cells showed mineral deposits after about 1 week of culture when incubated in the presence of microcarrier beads. These deposits appeared as white spots on the dish surface, and under light microscopy the cells showed multiple cell layers and mineralization around the microcarriers. The deposits stained positive with calcium-specific Von Kossa's method. Using conventional assay, alkaline phosphatase activity (ALP) and parathyroid hormone-stimulated intracellular cAMP production were lower in the microcarrier cultures than in the control, but using cytochemical methods, high alkaline phosphatase activity was found around the microcarriers. These results indicate that microcarriers facilitated the formation of multiple cell layers and provided a culture environment for mineralization.     

Angiopoietin-like protein 3 induces podocytes actin rearrangement via integrin beta 3

Objective To explore whether Angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) is involved in podocyte actin rearrangement, and to analyze whether integrin β3 signal pathway is a key in ANGPTL3 inducing actin rearrangement. Methods The cultured podocytes were divided into six groups: wild type, ADR treated, ADR+Dex, MOCK, ANGPTL3- cDNA, miRNA, and AD +miRNA group. (1) We observed actin cytoskeleton using Invitrogen reagents with confocal microscopy; (2) Actin cytoskeleton after blocking β3 on podocytes was; (3) The expression of total FAK and p-FAK was through Western blotting. Results (1) The wild type podocyte's cytoskeleton is arranged orderly. After ADR treatment, podocyte's actin are rearranged and weaken (P﹤0.05). There was no significant difference in actin arrangement between knock-down and MOCK group. In ANGPTL3-cDNA group the podocyte actin was also significantly rearranged; on the contrary, in miRNA+ADR group, the actin rearrangement never obviously happened (P﹤0.05). (2) Over-expression of ANGPTL3 podocytes blocked integrin β3 did not happen actin rearrangement. (3) The expression of p-FAK significantly increased in over-expression ANGPTL3 podocytes. Conclusion ANGPTL3 is a key in inducing actin rearrangement. Intergrin β3 maybe a central pathway in ANGPTL3's role with podocytes.     

C3d3与hCGβ基因融合质粒对不同品系小鼠DNA免疫增强抗hCGβ体液免疫效应

目的通过分子佐剂C3d3增强人绒毛膜促性腺激素(hCG)β基因疫苗在不同品系小鼠的体液免疫效应。方法分别用pCMV4-hCG-βC3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ+pCMV4-C3d3联合免疫以辅助性T细胞(Th)2型优势的BALB/c小鼠和Th1型优势的C57BL/6小鼠,免疫剂量分别为5、10、50、100和500 pmol,同一剂量免疫两次、间隔3周。初次及加强免疫后每周采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗hCGβ抗体水平。硫氰酸钠洗脱法ELISA分析抗hCGβ抗血清亲和力。结果两种品系小鼠pCMV4-hCG-βC3d3免疫产生抗hCGβ抗体的时间和效价均显著早(高)于pC-MV4-hCGβ和联合免疫组。在50 pmol免疫剂量时,C3d3在两种品系小鼠呈现出最强的佐剂活性,分别使hCGβ的免疫原性增强了400倍(BALB/c)和251倍(C57BL/6)。pCMV4-hCG-βC3d3组两个品系小鼠亲和力成熟较快。结论在Th2型及Th1型免疫优势的不同品系小鼠,分子佐剂C3d3均能增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应。     

Characterization of γδ T cell subsets in organ transplantation

γδ T cells are innate‐type lymphocytes that preferentially act as regulators of local effector immune responses. Recent reports found an altered distribution of the two main subpopulations of blood γδ T cells (Vδ1 and Vδ2) in operationally tolerant liver transplant recipients. Based on this, γδ T cells subset quantification was proposed as a biomarker of immunologic risk in liver transplantation. The specific characteristics of γδ T cell subsets in transplantation remain however unknown. We have investigated here the phenotype, repertoire and functional properties of γδ T cell subsets in a large population of allograft recipients. Our results indicate that alterations in the γδ T cell compartment are not restricted to tolerant liver recipients. In fact, most immunosuppressed liver and kidney recipients also display an enlarged peripheral blood γδ T cell pool mainly resulting from an expansion of Vδ1 T cells exhibiting an oligoclonal repertoire and different phenotypic and cytokine production traits than Vδ2 T cells. We propose that persistent viral infections are likely to contribute to these alterations. Our data provide novel insight in the biology of γδ T cells and a rationale for exploring these lymphocytes in more depth into the pathogenesis of viral infections in transplantation.     

胆管癌中14-3-3蛋白各亚型的表达及其临床意义

目的 探讨14-3-3蛋白各亚型在胆管癌组织中的表达情况及其临床意义.方法 采用石蜡包埋组织,进行免疫组织化学染色,分析14-3-3蛋白各亚型在20 例胆管癌及5 例胆管癌旁正常组织的表达状态,探讨其与胆管癌临床病理参数之间的关系.结果 14-3-3 蛋白β、γ、ε、ζ、η、θ和σ亚型在胆管癌组织原发灶表达的阳性率分别为85.00% (17/20)、85.00% (17/20)、55.00% (11/20)、75.00% (15/20)、50.00% (10/20)、80.00% (16/20) 和80.00%(16/20).其中,β、γ、η、σ、ε和θ亚型与癌旁正常胆管组织比较,具有统计学意义(P<0.05),而ζ亚型无统计学意义(P>0.05);14-3-3蛋白阳性表达率与胆管癌的分化程度、恶性级别及是否淋巴结转移均无差别(P>0.05).结论 14-3-3蛋白七个亚型中β、γ、η、σ、ε和θ亚型在胆管癌原发组织中高表达,表明14-3-3蛋白在胆管癌的发生过程中具有重要作用.     

TENOMODULIN基因转染对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用

目的研究过表达Tenomodulin(TNMD)对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用。方法体外培养NIH3T3和C3H10T1/2细胞系,利用脂质体法在两种细胞系中分别转染pCAGGS空载体和pCAGGS-TNMD表达载体,G418进行稳定筛选。RT-PCR确认成功转染后,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,同时定量PCR检测肌腱相关基因的表达情况。结果两种细胞系转染后细胞形态均无明显改变。基因水平上,NIH3T3细胞过表达TNMD后,collagenⅥ和biglycan显著降低,collagenⅠ没有显著差别。而在C3H10T1/2细胞中,collagenⅠ和biglycan显著升高,collagenⅥ没有显著差别。结论过表达TNMD对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系的细胞形态没有影响,但能影响肌腱相关基因的表达情况。