CD59基因的突变并真核表达载体的构建

目的 构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体.方法 选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR 定点诱变扩增突变基因, 重组入克隆载体PMD18-T-Vector, EcoRⅠ单酶切获得目的 基因,重组入真核表达载体pIRES.结果 通过PCR定点诱变成功获得两种目的 CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES-m1CD59、pIRES-m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp.结论 重叠延伸 PCR法诱变经济可靠,重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础.     

人突变CD59基因表达蛋白功能的研究

①目的构建8种突变CD59基因真核表达系统，观测突变的人CD59基因在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达及抗补体活性。②方法以荧光活化细胞分类法、免疫荧光法及免疫印迹法检测突变CD59基因转染CHO细胞表达的情况，染料释放实验检测正常突变的CD59分子糖基化前后的抗补体活性。③结果转人突变CD59基因组荧光阳性细胞百分率明显高于对照组，染料释放率低于对照组。④结论CD59突变基因可在CHO细胞表面得到有效表达，该CD59分子具有抗补体活性，但在高糖环境下易被糖基化失活而失去抗补体活性。     

人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定

目的获得纯化人突变CD59（hmCD59）蛋白,制备其特异性抗体,对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDS-PAGE检测hmCD59的表达情况,表达产物经ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清,以此抗血清鉴定纯化产物。结果hmCD59在CHO细胞获得表达,ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白,hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白,为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。     

糖尿病病人突变CD59蛋白在真核细胞中的表达

目的 构建两种含有人CD59蛋白突变体的真核表达载体,获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞真核表达系统,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础.方法 将两种含有不同突变体的人CD59全长cDNA序列重组pALTER质粒,应用阳离子脂质体导入法与pcDNA共转染CHO细胞,用G418筛选阳性克隆,应用细胞免疫组化及流式细胞仪检测CD59在CHO细胞表面的表达. 结果 含有人CD59两种突变体的重组pLATER质粒经酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长496 bp的电泳条带,与所插入片段完全相符.运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒共转染CHO细胞成功,筛选出的阳性克隆经细胞免疫组化检测,证明突变的CD59可在CHO细胞表面表达,流式细胞仪测定表达率分别为68.6%、71.7%.结论 成功建立了两种高效表达人CD59突变体的真核表达系统,能够进一步研究人CD59的突变体糖基化及抗补体活性,为阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定了基础.     

人突变CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

①目的构建人突变CD59的真核表达系统，并筛选高表达细胞。②方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染人中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；G418筛选出阳性克隆，流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Western-blot筛选高表达CD59细胞。③结果成功构建人突变CD59的真核细胞表达系统；运用各种免疫学技术检测获得CD59高表达细胞。④结论人突变CD59在CHO细胞中高表达，为进一步研究CD59分子的功能奠定基础。     

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

pLEGFP-mIFNγ重组质粒的构建及神经干细胞转染

目的：构建pLEGFP-mIFNγ真核表达质粒,以获得带有绿色荧光蛋白的γ干扰素融合蛋白。 方法：以克隆质粒pcDNA3.1-mIFNγ为模板,用PCR方法扩增mIFNγ DNA 片段,利用pEGFP-C1质粒载体构建pLEGFP-mIFNγ重组质粒,用酶切电泳验证重组质粒的正确性。脂质体转染包装细胞PA317,利用PA317病毒上清转染神经干细胞。 结果：PCR结果显示扩增片断大小约500 bp,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约7 400 bp。pLEGFP-mIFNγ成功转染神经干细胞。 结论：pLEGFP-mIFNγ质粒构建成功,能够有效转染神经干细胞,并进行示踪。     

人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测

目的 研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性.方法 取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418 筛选稳定表达细胞克隆;酶免疫法及RT-PCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达;制备抗CD59多克隆抗体,MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性.结果 野生型及突变型CD59质粒扩增成功,并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株;与野生型CD59 相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异.结论 CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,有望应用于肿瘤治疗.     

重组质粒转染293细胞及表达

目的:探究通过脂质体转染技术介导重组质粒pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP转染293细胞的方法。方法:采用Lipofectamine 2000方法将包含目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP的质粒转染293细胞。在转染24 h后于荧光显微镜下观察红色荧光出现情况。收集并浓缩稳定转染后293细胞的上清液,提取细胞膜蛋白和胞浆蛋白,采用Western blot方式判断转染细胞是否表达目的蛋白。结果:①荧光显微镜下可观察到红色荧光蛋白(RFP)发出红色荧光。②Western blot鉴定结果:提取稳定转染的293细胞胞浆蛋白Western blot鉴定可见到大小为62 kD左右的条带。浓缩的上清蛋白与提取的胞膜蛋白West-ern blot鉴定未见到目的蛋白表达。结论:应用脂质体转染技术,成功介导目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP转染到293细胞中,为进一步研究重组CD13单链抗体对血液肿瘤的靶向杀伤作用打下了实验基础。     

Smad4真核表达质粒的构建及转染结肠癌细胞系SW480

目的 构建Smad4真核表达质粒并筛选稳定表达野生型Smad4基因的SW480结肠癌细胞系。方法 提取正常人体胎盘组织总RNA,PCR扩增人野生型 Smad4基因,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建pcDNA3.1(+)-Smad4重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定,脂质体介导方法转染结肠癌细胞系SW480,G418筛选稳定表达株,RT-PCR方法检测其mRNA表达水平。结果 Smad4基因的PCR电泳结果显示在1 700bp左右有一明显亮带,连接载体后经鉴定证实为人Smad4-cDNA;稳定转染Smad4基因的SW480细胞RT-PCR结果提示Smad4的mRNA表达水平比对照细胞组明显升高。结论 成功扩增野生型Smad4基因,构建Smad4真核表达质粒,并筛选出Smad4基因稳定表达的SW480结肠癌细胞系。     

人CD59基因突变细胞模型的建立

目的建立表达人突变CD59的细胞模型,初步研究其活性。方法以正常的CD59基因全长cDNA序列为模板,应用重叠延伸PCR法产生突变使CD59糖基化基序K41-H44突变为K41-K42,产生突变CD59基因,将其克隆于pALTER质粒中,构建出重组真核表达载体。应用脂质体介导法,与pcDNA3质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,以G418筛选阳性克隆。应用免疫化学染色及Western blot方法进一步检测突变CD59分子在转染细胞膜表面的表达。通过荧光染料释放试验,对突变CD59蛋白糖基化前后的补体限制活性进行检测。结果筛选出的阳性克隆细胞膜表面有突变CD59分子表达。将细胞的裂解物进行Western blot检测证实,在相对分子质量20000处可见1条与CD59相当的蛋白带。表达有突变CD59分子的阳性克隆细胞染料释放率低于对照组,糖基化后染料释放率明显升高。结论成功地获得了表达人突变CD59分子的细胞株。     

CD59在胃癌中的表达及其生物学意义

目的探讨CD59基因在胃癌中的表达及其生物学意义。方法以胃癌细胞系,胃癌组织和癌旁正常配对组织为材料,采用RT-PCR法和Real-Time PCR法测定CD59基因的mR-NA表达水平。结果CD59 mRNA在7株不同来源、不同分化程度的胃癌细胞系中表达水平不相同;在19对配对组织中有16对(16/19,84%)肿瘤组织表达水平低于与其配对的癌旁正常组织。结论CD59 mRNA的表达在胃癌细胞系中表现出组织特异性,其表达水平与胃癌细胞分化程度有一定关系;并且CD59 mRNA在胃癌组织中普遍低表达可能是肿瘤发生的早期事件之一,对胃癌的发生发展可能具有重要生物学意义。     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响

目的 研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响.方法 构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体-pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RT-PCR及Western blot方法检测细胞表面CD59 mRNA及蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖抑制率.结果 成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与WT-A2780比较均明显下降(t=9.21、7.20,P<0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P<0.05).结论 CD59配体肽基因可影响人卵巢癌细胞A2780表面CD59的表达,有望用于肿瘤治疗.