小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。     

肝癌组织特异性小鼠IL─3、TNF逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

从ｐＳＶ２３ＳＭＴＮＦ和ｐＳＰＭｏＩＬ─３质粒分别切下小鼠肿瘤坏死因子（ｍＴＮＦ）和小鼠白细胞介素３（ｍＩＬ─３）ｃＤＮＡ，并切除ｍＩＬ─３ｃＤＮＡ３＇端ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ不稳定序列，以两种细胞因子ｃＤＮＡ作为目的基因，分别克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ多克隆位点，再于目的基因上游分别插入小鼠白蛋白启动子增强子序列（Ａｌｂｅ／ｐ），构建成功两种肝癌组织特异表达性细胞因子逆转录病毒载体，经磷酸钙共沉淀法导入包装细胞ｐＡ３１７中包装成重组病毒颗粒，并测转染率。经ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测定重组病毒Ｎｅｃ抗性感染率后，在８μｇ／ｍｌＰｏｌｙｂｒｅｎｅ存在下感染肿瘤细胞，经４００μｇ／ｍｌ活性Ｇ４１８选择后测转基因肿瘤细胞培养上清中表达相应细胞因子，证明ｍＩＬ─２、ｍＩＬ─３特异地在表达白蛋白的小鼠肝癌细胞中表达（Ｐ＜０．００１）。     

用双拷贝逆转录病毒载体转导人G－CSF cDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆位点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证明嵌合的目的基因在感染细胞中通过基因复制而转染到５＇ＬＴＲ的转录单位之外并且在染色体ＤＮＡ中稳定整合，复制产生两个拷贝，在３＇ＬＴＲ和５＇ＬＴＲ中各有一个基因。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

APA-3T3细胞微囊的深低温保存

目的:通过优选冻存液的成份和浓度,建立低温保存APA微囊化小鼠成纤维细胞(3T3细胞)的方法。方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊(APA)包裹3T3细胞制成APA-3T3细胞微囊。以高糖DMEM培养液为基础冻存液,分别加入不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)或牛血清白蛋白(BSA)。分别将不同的冻存液加入APA-3T3中。按程序控制降温梯度,置于液氮中保存。快速复温后,光镜下观察APA-3T3的形态、细胞活率及膜通透性。结果:①10%DMSO组的微囊内细胞活率降低最少,细胞活率达(75.68±1.54)%,P<0.01。微囊完好率达到(94.48±0.90)%,P<0.01。②与其它组相比,4%BSA组的微囊内细胞活率降低程度最小,活率达(73±1.26)%,P<0.01。微囊完好率最高,为(85.1±0.82)%,P<0.01。③加入不同成份和浓度的冻存液对微囊的通透性没有明显影响。结论:在冻存液中加入10%DMSO和4%BSA,可在低温保存的过程中较好地保护细胞的存活及微囊的完整性。     

腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应.方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况.将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数.结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系.MOI为100倍时,转染效率达95%.RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达.2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P＞0.05).转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P＜0.01).结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生.     

钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株增殖影响的研究

目的探讨不同浓度钒化钠(sodium vanadate,SV)对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株增殖作用的影响。方法将培养的NIH3T3细胞给予不同浓度及时间的SV刺激,以噻唑蓝(MTT)比色法检测小鼠成纤维NIH3T3细胞增殖及增殖抑制情况。结果与对照组比较,0.1μM对细胞增殖无影响(P>0.05);1.0、5.0、10.0μM SV可以促进细胞增殖,而200μM SV抑制其增殖(P<0.01),不同处理时间变化趋势一致;100μM SV对细胞作用随处理时间不同而不同。结论SV对NIH3T3细胞增殖作用因处理剂量和时间不同而呈现差异。     

槲皮素抗NIH-3T3细胞凋亡的作用

目的:探讨槲皮素对过氧化氢(H2O2)诱导NIH-3T3细胞凋亡的抑制作用。方法:体外培养小鼠成纤维细胞,取对数生长期的成纤维细胞分成四个实验组。对照组(C):仅加含有10%胎牛血清的DMEM培养基。槲皮素前保护组(Qb):先用含有50μmol/L的槲皮素培养基作用24 h,再换含有0.5 mmol/L H2O2作用细胞30 m in。槲皮素后保护组(Qa):先用0.5 mmol/L H2O2作用细胞30 m in,再换含有50μmol/L的槲皮素培养基作用24 h。H2O2实验组(H2):先用含有0.5 mmol/L H2O2作用细胞30 m in,再换仅含有10%胎牛血清的DMEM培养基作用24 h。取培养细胞提取DNA和制备1×107/m l细胞悬液的滴片,应用TUNEL和Ladder电泳检测细胞凋亡率;应用细胞免疫组化技术检测Bc l-2、Bax、Caspase-3蛋白质的表达。结果:由TUNEL和Ladder实验得出,Qb组的细胞凋亡率明显低于H2组和Qa组。由细胞免疫组化技术检测分析得出,Qb组与Qa、H2组相比,Bc l-2的表达增高,Bax、Caspase-3的表达减低。结论:槲皮素可能是通过上调Bc l-2的表达,下调Bax、Caspase-3的表达,对H2O2诱导NIH-3T3细胞的凋亡起到抑制作用。     

小鼠白细胞介素-3的制备及其检测条件的分析

从小鼠白细胞介素-3(IL-3)分泌细胞株WEHI-3获取了IL-3,同时用小鼠IL-3依赖细胞株32-D检测IL-3和滴定标本中IL-3的活性单位,并对检测条件进行了探索。结果表明,WEHI上清中含高活性IL-3,不含IL-2,其最佳收集条件是5×10~5/ml细胞浓度培养48h。32-D细胞生长依赖于IL-3。检测细胞的浓度、培养时间及同位素加入时间直接影响检测结果,最佳检测条件是(5～10)×10~5/ml细胞浓度、培养36h、终止前12h加~3H-TdR。     

SRSV/3T3和NIH/3T3细胞膜的分离和蛋白质组分的初步比较

应用甘油低渗两相分配法分离了SRSV/3T3细胞质膜(SM)和NIH/3T3细胞质膜(NM)。经Na~+、K~+-ATP酶和葡萄糖-6-磷酸酶等标志酶活性鉴定,表明SM和NM纯度较高。经SDS-PAGE分析比较,发现SM和NM的蛋白质组分有较明显差异。SM有7种独特的组分,分子量分别为2.29×10~(-22)、2.18×10~(-22)、9.79×10~(-23)、9.60×10~(-23)、8.63×10~(-23)、5.49×10~(-23)和4.78×10~(-23)kg。NM有两种特有的组分(1.15×10~(-22)和4.17×10~(-23)kg)。在彼此共有的蛋白质组分中,也有许多组分在含量和电泳迁移速度上存在着程度不同的区别。     

原花青素诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制研究

目的：探讨原花青素在体外诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制。方法：体外培养人前列腺癌PC-3细胞株,用100,200,300μg／ml原花青素作用24h。荧光素标记的连接素V（Annexin V—fluoresein isothiocyanate,Annexin V—FITC）和碘化吡啶（propidium iodide,PI）双染检测原花青素对PC-3细胞凋亡的影响,采用流式细胞术检测以不同浓度原花青素作用后PC-3细胞线粒体膜电位（△ψm）的变化。结果：100μg／ml原花青素作用细胞24h,5．64％的细胞出现早期凋亡,84．7％的P03细胞呈现线粒体膜电位降低;300vg／ml原花青素组P＆3细胞凋亡率和坏死率分别为44．86％、50．81％。结论：源花青素可在体外诱导PC-3细胞凋亡,其机制与降低线粒体膜电位有关。     

Verapamil inhibits 3T3-L1 preadipocyte differentiation

Objective: To investigate the effect of the calcium channel blocker verapamil on adipocyte differentiation and its mechanism of action. Methods: Preadipocytes from 3T3-L1 strain mouse embryos were cultured and differentiated into matured adipocytes in vitro. Verapamil was added to the culture medium in the concentration of 30 μmol/L on Day 0. Cell differentiation was determined by Oil Red O staining and marker gene mRNA expression was evaluated and compared by RT-PCR. The fluo-3/AM probe and laser scanning confocal microscopy were used to measure intracellular calcium concentrations. Results: ①The differentiation rate of 3T3-L1 preadipocytes exposed to verapamil was lower than that of untreated cells. ②Verapamil promoted the retention of pref-1 gene expression. Lipoprotein lipase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group on Day 4, Day 6 and Day 8 (P < 0.05) and resistin expression was significantly lower than that in the control group on Day 6, Day 8 and Day 10 (P < 0.05). Fatty acid synthase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group from Day 2 (P < 0.05). ③ Intracellular concentrations of calcium [Ca2+]i in the verapamil group were significantly decreased compared with those in the control group on Day 2, Day 4 and Day 6 (P < 0.05), while there was no obvious difference between the two groups on Day 0 (P > 0.05). Conclusion: In 3T3-L1 preadipocytes verapamil significantly reduced adipocyte differentiation, down-regulated the mRNA expression of three marker genes for adipocytes differentiation, and prolonged the mRNA expression of an inhibitor of differentiation. The inhibitory effect of verapamil on differentiation may involve its role as a blocker of calcium influx in adipocytes.     

3- 甲基腺嘌呤对 EPCs 超微结构和 LC3-II蛋白表达的影响研究

目的 探索3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)超微结构和自噬体膜型(LC3-II)蛋白表达的 影响。方法 采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定;分成对照组和4个3-MA浓度组(分别加入1.25、2.5、5、 10mmol/L 3-MA) 。采用单丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色和透射电镜观察 3-MA 给药后 EPCs 自噬的发生。Western blot 检测 3-MA给药后EPCs内LC3-II蛋白表达的变化。结果 MDC荧光染色和透射电镜均观察到5、10mmol/L组EPCs超微结构明显 区别于正常及死亡细胞,是典型的凋亡形态图。Western blot 检测 3-MA 给药 24h 后 EPCs LC3-II 蛋白表达降低;与对照组比较,5、 10mmol/L组LC3-II蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论 5、10mmol/L的3-MA对EPCs超微结构和LC3-II蛋白表达均有影响, 推测浓度≥5mmol/L 的 3-MA 能抑制 EPCs 的自噬。