宫颈癌相关新基因的筛选、克隆及鉴定

目的:筛选、克隆及鉴定宫颈癌相关基因———BLCAP。方法:利用基因芯片技术对1例原发性宫颈癌患者的癌组织及其癌旁正常组织进行分析;将在宫颈癌组织中表达显著降低的BLCAP基因克隆到pET-28(a)表达载体上,以构建原核表达重组质粒pET-28(a)-BLCAP,通过PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序等技术鉴定阳性重组子。结果:通过基因芯片分析发现存在表达差异的原癌和抑癌基因共11条,其中表达降低最明显的是BLCAP基因。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,即BLCAP基因共264 bp,基因序列无改变,基因插入后阅读框(ORF)正确。结论:筛选出了在宫颈癌中表达显著降低的BLCAP基因并成功构建了pET-28(a)-BLCAP原核表达质粒,为表达BLCAP目的蛋白及研究该蛋白的性质奠定了基础。     

人类Quaking基因的cDNA克隆

研究发现 ,在Ｑｕａｋｉｎｇ(ＱＫ)突变小鼠 (战栗者 )中 ,由于位于 17号染色体ＱＫ基因 (ＱＫ ,ＱＫ 1～ 7,ＧｅｎＢａｎｋ登记号Ｕ44 940 )的缺失突变或点突变 ,导致其神经系统 (包括中枢及周围神经系统 )的髓鞘形成障碍 ,临床表现为以后半身为主的震颤等 ,严重者可于胚胎早期死亡[1,2 ] 。人类ＱＫ基因尚未克隆 ,为此。我们通过同源序列分析方法以小鼠的ＱＫ 1～ 7基因的编码区序列作为信息探针 ,成功地克隆了人类ＱＫ的 6种剪接型。一、材料和方法1 信息分析方法 ;信息分析方法在ＳＵＮ工作站采用ＧＣＧ软件包进行 ,根据大规模测序提供…     

人蛋白激酶CβⅡ基因开放读码框的克隆及序列分析

目的:克隆人蛋白激酶CβⅡ基因(PRKCB1)的开放读码框(Open reading frame,ORF),为其进一步的功能研究提供基础.方法:采用逆转录-巢式PCR法,从人脐静脉内皮细胞株中扩增出含PRKCB1基因ORF全长的片段,所得片段经加"A"处理并插入T载体.经蓝白筛选,用特异引物扩增阳性重组子,得到编码人蛋白激酶C βⅡ(Protein kinase C βⅡ,PKC βⅡ)基因的ORF,并与T载体相连,测序鉴定.结果:通过巢式RT-PCR及T/A克隆获取了PRKCB1基因的ORF,测序结果与GenBank报道序列一致.结论:成功克隆了PRKCB1基因的ORF,在技术路线上可以为某些难克隆的基因提供参考.     

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

HL—60细胞内同源盒HOXA、cDNA基因的克隆

目的：研究同源盒ＨＯＸ基因的表达在ＡＴＲＡ诱导白血病细胞分化中的作用方法：利用我们建立的一种高效、简单的ｃＤＮＡ克隆方法－ＨＯＸ家诞基因指纹图技术,克隆ＨＬ－６０细胞内的ＨＯＸ ｃＤＮＡ基因。采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术初步探讨ＡＴＲＡ对所克隆的ＨＯＸ基因表达的影响。结果：筛选出一个在ＨＬ－６０细胞内有表达的同源盒基因－ＨＯＸＡ１基因ｃＤＮＡ片段。初步研究证实,此基因的ｍＲＮＡ水平在ＡＴＲＡ的作用下     

蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增。通过PacI酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装。包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达。结果经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺...     

HL-60细胞内同源盒HOXA1、cDNA基因的克隆

目的：研究同源盒ＨＯＸ基因的表达在ＡＴＲＡ诱导白血病细胞分化中的作用。方法：利用我们建立的一种高效、简单的ｃＤＮＡ克隆方法－ＨＯＸ家庭基因指纹图技术,克隆ＨＬ－６０细胞内的ＨＯＸｃＤＮＡ基因。采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术初步探讨ＡＴＲＡ对所克隆的ＨＯＸ基因表达的影响。结果：筛选出一个在ＨＬ－６０细胞内有表达的同源盒基因一ＨＯＸＡＩ基因ｃＤＮＡ片段,初步研究证实,此基因的ｍＲＮＡ水平在ＡＴＲＡ的作用下被上调。结论：ＡＴＲＡ可诱导ＨＬ－６０细胞内ＨＯＸＡ１基因表达增强。提示在ＡＴＲＡ诱导细胞分化而治疗恶性肿瘤的分子机制中,包括上调ＨＯＸＡ１基因表达而致白血病细胞分化成熟。     

克隆超基因家族中新基因的一种PCR同源引物

目的 用同源引物克隆ＲＮＡ低丰度表达的小鼠β－趋化因子受体。 方法：将β－趋化因子受体小鼠ＭＩＰ－ＩαＲ，人ＭＣＰ－１Ｒ和大鼠ＩＬ－８Ｒ跨膜区中高度保守的氨基酸序列中的核苷酸进行相似序列对比后，设计出同源引物，再用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＤＮＡ片段，经基因库检索为该超基因家族中的新基因序列后设计特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ扩增出该新基因。 结果：成功克隆出小鼠β－趋化因子受体５（ＣＣＲ５）ｃＤＮ     

Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定

目的 用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721,筛选阳性克隆并鉴定.方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721,pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、2:9,400 μg/mL G418筛选阳性克隆后,传代扩增,Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况.应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照.结果 Western Blot显示,转染后的SMMC-7721经G418筛选,除一个克隆不高表达外,其余克隆均高表达Grp78.结论 Crp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8:2(转染试剂/DNA),由于假阳性克隆的存在,筛选后的克隆需要鉴定.     

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2 C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础.方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2 C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定.结果...     

人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

目的构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法人工合成1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物，以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因。用A-T克隆法与pUCm-T载体连接后，再定向插入原核表达载体pBV220，将重组体pBV220．hBDNF转化大肠杆菌DH5a，经42℃热诱导表达。结果经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF，并成功表达出hBDNF蛋白。结论该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达，表达效率达25％，为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。     

一种新型单羧酸转运体基因的分离与克隆

目的 分离、克隆编码肾脏甲酸盐（formate)和（或）草酸盐（oxalate)转运体的cDNA,以研究Cl^-在近端肾小管转运的机制。方法 根据细菌Oxlt(formate-oxalate交换体）的基因序列在哺乳动物表达序列标签（express sequence tag,EST)数据库中查找与其相似的cDNA。按筛选到的cDNA设计探针,应用小鼠多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 在小鼠肾cDNA文库中有一个与Oxlt极其相似的EST,序列分析显示了其有一编码429个氨基酸蛋白质的开放阅读框。从编码的顺序中可发现该序列与单羧酸转运家族（monocarboxylate transporter,MCT)极为相近,与小鼠MCT1的氨基酸一致性为30％,与小鼠MCT2为33％,与大鼠MCT329％。其中第14－158个氨基酸中有25％与OxlT相同。Northern印迹发现,新的基因在小鼠肾脏中表达最多,肝脏和心脏中极少表达。结论 该基因是一新型的MCT家族成员,主要在肾脏中表达,其功能可能是介导肾小管的formate转运。     

睾丸表达新基因HSD-28的克隆及其编码蛋白质的研究

目的 研究从人初级精母细胞特异EST文库中克降的新基因HSD-28及编码蛋白质在精子发生过程中的表达及可能发挥的功能.方法 利用根据本实验室构建的人初级精母细胞特异EST文库,通过电子克隆方法,从网络数据库资源获取基因HSD-28.纯化原核表达系统表达的HSD-28蛋白,以此免疫新西兰白兔制备针对HSD-28的特异性多克隆抗体.采用免疫组化的方法研究HSD-28在人睾丸组织中的表达定位.最后,利用酵母舣杂交系统筛选与HSD-28相互作用的蛋白质.结果 克隆得到了的HSD-28基因,提交GenBank获得登陆号为AY251533,全长为641个碱基,其中开放阅读框为504碱基,编码一个由168个氨基酸构成的蛋白质,命名为HSD-28蛋白.将构建的pET-30a-HSD-28重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌,表达并纯化了HSD-28蛋白,大小约为28kDa.免疫组织化学结果显示,HSD-28蛋白特异的定位于人精原细胞和早期初级精母细胞.筛选得到与HSD-28相互作用的两个阳性克隆45#和106#.结论 从人睾丸cDNA文库中成功克隆得到HSD-28基因,其编码蛋白质表达定位于人精原细胞和初级精母细胞中,可能参与精子发生过程中减数分裂的调节.     

人白细胞介素-24基因的克隆及序列测定

目的克隆人白细胞介素-24(hIL-24)基因，以供重组表达。方法利用自行设计合成的一对引物，采用RT-PCR技术从LPS活化的人外周血单个核细胞的总RNA中分离hIL-24cDNA并重组到pUCl9载体上，进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果PCR及酶切产物电泳结果均证明所克隆的基因为621bp。经序列测定证实所克隆的hIL-24与GenBank报道的结果完全一致。结论该基因系国内首次获得并经序列测定证实的hIL-24cDNA基因。这为进一步在真核或大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL-24，更深入地研究其作用机制以及临床应用奠定了坚实的基础。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

粒／巨噬细胞集落刺激生长因子的基因克隆表达

利用逆转录聚合酶链反应从人外周血淋巴细胞克隆获得全长ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ片段克隆至质粒表达载体ＰＶＢ２２１，转化大肠杆菌ＤＨ５α筛选获得了高表达人粒／巨噬细胞集落刺激生长因子的工程菌。表达的人粒／巨噬细胞集落刺激生长因子经ＳｅｐｈａｃｒｙＩＳ－２００分子筛纯化及Ｑ－Ｓｅｐｈａ－ｒｏｓｅ阴离子交换纯化，获得了高纯度的粒／巨噬细胞集落刺激生长因子，并有较好的生长学活性。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。     

人瘦素基因克隆与序列测定

【目的】构建人瘦素基因cDNA克隆 ,并进行序列分析。【方法】用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因cDNA ,获得片段 (6 40bp)连接至 pUC19载体 ,并转化大肠杆菌DH5α。以末端终止法进行序列测定。【结果】所克隆的人瘦素cDNA含全长的人瘦素基因编码区 ,仅 2 87位的腺苷酸被鸟苷酸代替 ,导致 96位编码谷氨酰胺的密码子CAA改变为编码精氨酸的CGA ,其意义尚待阐明。【结论】以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人瘦素基因cDNA克隆。     

人P选择素胞外区Lectin-EGF片段的基因克隆及表达研究

目的 构建表达人P-选择素胞外凝集素-表皮生长因子样区(Lectin—EGF)片段的基因工程菌。方法 从人血小板中提取总RNA，经RT—PCR得到P-选择素cDNA，用PCR方法扩增其中的Lectin—EGF片段，并将其克隆到原核表达载体PBV220中，再转化宿主菌DH5α。结果 通过酶切、PCR和基因序列分析确定重组载体片段为目的基因的核苷酸序列，并在大肠杆菌中获有效表达重组蛋白。结论 表达人P-选择素胞外区Lectin—EGF片段的基因工程菌的成功构建，为在大肠杆菌中大量表达该表位片段对应蛋白从而制备其抗体提供基础。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。