错配杂交酶联免疫法检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

目的建立一种基于错配杂交及酶联免疫检测亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahy drofolate redueatase，MTHFR）基因多态性的新方法。方法针对多态位点设计两条寡核苷酸探针，分别与野生型及突变型序列互补。将两条地高辛标记的探针分别与含多态位点C677T的PCR扩增产物杂交，然后显色检测，根据两条探针的吸光度值之比确定样品的基因型。结果用本法随机检测了50例DNA样品，结果可见三种基因型的发光值之比可以严格区分，其中野生型（C／C）15例，杂合型（C／T）28例，突变型（T／T）7例，与参考方法（PCR—RFLP）的检测结果完全一致。结论本方法操作简便、检测快速而且费用低廉，可广泛应用于MTHFR基因突变及多态性检测。     

PCR产物液相杂交检测的优化

目的 为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速。方法 通过改进杂交液的成分,选择最佳的探针浓度,使5＇端标记生物素的PCR扩增产物与5＇端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃ 10 s冷却到37℃ 10 s即完成杂交。杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果 液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300 ml·L~(-1),探针浓度为0.5μmol·L~(-1),杂交温度为37℃。对60～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×10~4copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100％(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBe(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6％(22/28);HBsAg(+)、抗HBe(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7％(16/24),其余为阴性。结论 该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用。     

地高辛标记引物酶显色法检测HBV基因多态性及应用

目的　建立地高辛标记引物酶显色法 ,用于DNA芯片检测HBV基因多态性 ,并对实验条件进行优化。方法　用地高辛标记引物进行HBVDNA前C/C区和P区双重PCR ,制备含地高辛标记的DNA样品目的片段 ,并将目的片段杂交于含HBVDNA核苷酸序列野生型及突变型探针的DNA芯片上 ,用抗地高辛抗体 碱性磷酸酶进行显色 ,并转印于尼龙膜上 ,最后用光学扫描仪读取结果。结果　通过一次杂交反应同时获取HBVDNA前C/C区 (1896、1814 )、BCP区 (176 2、176 4 )和P区 (5 5 2 )位点的信息。杂交温度与时间为 4 2℃ 1h、酶作用和显色时间分别为 30min和 4 5min时结果较理想 ,采用高盐浓度洗涤获满意杂交信号 ,批内CV均在 15 %左右 ,敏感度为 2 .0× 10 3 拷贝 /ml。 5 0例乙型肝炎患者突变率 5 2 .0 % (2 6 / 5 0 ) ,以上各位点突变率分别为 34.0 %、2 2 .0 %、38.0 %、38.0 %、4 .0 %。结论　地高辛标记引物酶显色法用于芯片检测HBV基因常见位点多态性 ,简便易行 ,试剂成本显著降低 ,不需特殊设备 ,易于临床推广应用。     

乙型肝炎病毒聚合酶链反应液相杂交酶免疫检测的定性判断值研究

目的探讨乙型肝炎病毒 (HBV)聚合酶链反应 (PCR)液相杂交酶免疫检测的定性判断值设立和灰区范围的计算方法。方法以 HBV为目的靶 DNA,引物 P1 5’端标记 Bio,PCR扩增 35个循环。扩增产物与 5’端标记Dig的探针混合进行液相杂交 ,杂交后产物被 SA酶标板固定 ,经酶标记抗 Dig抗体结合、显色。结果实验结果显示 ,本试剂的检测敏感度在 3× 10 4拷贝 /m l。 3种参比品 A450 值的 95 %、99%分布范围之间不存在交叉区 ,其中临界阳性参比品 95 %分布范围下限值 (A450 )为 0 .182。 5 85例献血员血清标本的 A450 均值为 0 .0 37,P99上限值为 0 .12 3,灰区范围在 0 .12 3～ 0 .182。本试剂对“HBs Ag /HBe Ag /抗 - HBc ”标本的阳性检出率为 98.8% ,“HBs Ag /抗 - HBe /抗 - HBc ”标本的检出率为 5 4.8% ,阴性标本的检测有较高的特异性。结论本试剂设立的定性判断值(灰区计算方法 )具有很高的正确性、可操作性和临床实用性     

16S～23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针不同显色方法对结核患者痰标本的检测

目的：评价16S－23rDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光学对结核患者痰标本检测的应用价值。方法：采用生物素标记5′端18bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反 辣根过氧化物酶化学发光检测90例例结核患者和30例非结核患者痰标本,结果：痰标本基因组DNA直接与探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为22．2％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为33．3％,痰标本经引物PL1、PL2扩增（扩增产物350bp,）与寡核苷酸探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为77．8％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为83．3％,痰标本经引物b扩增（扩增产物250bp)与探针杂交,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为75．6％,80．0％,检测的敏感性高于痰涂片。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性。结论：寡核苷酸探针和250bpPCR扩增产物相结合,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法。     

乙型肝炎病毒聚合酶链反应液相杂交酶免疫检测的定性判断值研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶链反应(PCR)液相杂交酶免疫检测的定性判断值设立和灰区范围的计算方法.方法以HBV为目的靶DNA,引物P15'端标记Bio,PCR扩增35个循环.扩增产物与5'端标记Dig的探针混合进行液相杂交,杂交后产物被SA酶标板固定,经酶标记抗Dig抗体结合、显色.结果实验结果显示,本试剂的检测敏感度在3×104拷贝/ml.3种参比品A450值的95%、99%分布范围之间不存在交叉区,其中临界阳性参比品95%分布范围下限值(A450)为0.182.585例献血员血清标本的A450均值为0.037,P99上限值为0.123,灰区范围在0.123～0.182.本试剂对"HBsAg+/HBeAg+/抗-HBc+”标本的阳性检出率为98.8%,"HBsAg+/抗-HBe+/抗-HBc+”标本的检出率为54.8%,阴性标本的检测有较高的特异性.结论本试剂设立的定性判断值(灰区计算方法)具有很高的正确性、可操作性和临床实用性.     

地高辛标记DNA探针在微生物学诊断方面的应用

1988年,德国人 Dooley 等首次用地高辛标记的探针检测了结合 DNA 的蛋白质。这种方法操作方便、干扰少,可以在两天内出现结果。地高辛是从植物洋地黄中提取的固醇类半抗原物质。由连接臂共价结合到嘧啶环的5位上,构成地高辛标记的核苷酸类似物 Dig—11—dUTP。通过随机引物法掺入到探针分子内。探针与目的核酸序列杂交后,根据地高辛与抗地高辛抗体的亲和力,利用酶标记技术进行检测。地高辛探针     

用于PCR产物检测的液相杂交法的优化

目的　为了使液相交在检测更加灵敏、特异、快速。方法　通过改进杂交液的成分 ,选择最佳的探针浓度 ,使 5’端标记生物素的PCR扩增产物与 5’端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交 ,杂交条件为 :94℃ 10s冷却到 37℃ 10s即完成杂交。杂交后产物通过链霉素亲和素被固定在微孔表面 ,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离 ,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果　液相杂交的条件优化 :杂交液中DMSO浓度为 30 0ml/L ,探针浓度为 0 5 μmol/L ,杂交温度为 37℃。对 6 0bp～ 6 0 0bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异 ,可以检测到 1× 10 4copy的PCR产物 ,对 10 0例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBsAg( )、HBeAg( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 10 0 % (30 / 30 ) ;HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 10 0 % (30 /30 ) ;HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 78 6 % (2 2 / 2 8) ;HBsAg( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 6 6 7% (16 / 2 4 ) ,其余为阴性。结论　该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异 ,适合临床实验室使用     

问题解答1

问:何谓实时荧光聚合酶链反应定量检测?答:在普通ＰＣＲ扩增系统中,加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针。5′端标记荧光发射集团,3′端标记荧光淬灭集团,当探针完整时,后者抑制前者而不发光。有靶基因存在时,在ＰＣＲ复性阶段,探针与靶基因互补,ＰＣＲ延伸中,由于Ｔａｑ酶有5′3′的外切酶活性,引物沿模板延伸至标记探针结合处,将5′端报告集团切下,产生荧光,其强度与ＰＣＲ产物量成正比关系。荧光光谱分析仪可测得定量结果,它可反应原始模板定量。问题解答1@赵晓涛     

膜微阵列技术的建立及检测细菌条件的优化

目的　探讨膜微阵列技术检测细菌的可行性。方法　在细菌的 1 6SrRNA基因内设计了通用引物和特异性探针 ,将探针点在膜上制备微阵列 ,再与地高辛标记的DNA杂交 ,比较了随机引物标记法和PCR掺入标记法的灵敏度 ,探讨了硝酸纤维素膜和尼龙膜作基片的可行性 ,并比较了不同的固定条件和杂交条件下的杂交结果 ,以标准菌株DNA为样本 ,建立起微阵列技术。结果　随机引物标记法和PCR掺入标记法的灵敏度均为 0 .1pg ;尼龙膜较之硝酸纤维素膜可更好的结合寡核苷酸 ,经紫外线交联 3min ,与杂交液 3(5×SSC ,5g/LSDS ,1 %封闭剂 )在 5 5℃杂交结果最好。标准菌株除结核杆菌、变形杆菌外 ,均能与其对应的特异探针杂交。结论　利用膜微阵列技术检测细菌有快速、敏感、特异、无放射性污染的特点     

乙型肝炎血清标志物与HBV DNA含量的相关性分析

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测结果与血清标志物检测结果的相关性.方法 采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附(ELISA)法同步检测125份血清标本HBV DNA含量和HBV标志物.结果 125份血清标本中,47例HBsAg( )、HBeAg( )、抗-HBc( )患者血清HBV DNA检测阳性率为95.7%;35例HBsAg( )、抗-HBe( )、抗-HBc( )患者血清中HBV DNA检测阳性率为65.7%,血清HBeAg阳性组HBV DNA检测含量明显高于HBeAg阴性组.结论 结论 FQ-PCR法检测HBV DNA具有良好的特异性和灵敏度,为临床了解病毒的复制情况,选择制定治疗方案的和疗效观察提供了有力的依据.     

HBV DNA PCR检测在HBsAg阴性献血人群中的应用

目的 探讨HBsAg阴性献血者HBV DNA榆测的应用价值,评估核酸检测的必要性.方法 采用PCR检测HBsAg阴性献血者HBV DNA.采用8人份混合血样测定,超离心浓缩病毒,磁珠法提取病毒核酸.如HBV DNA为阳性,则进一步检测乙型肝炎病毒血清标志物5项.结果 HBVDNA检测限量为25 U/ml,23 225份标本中有4份为HBV DNA阳性,检出率为0.17‰.进一步检测其他HBV感染的血清学指标,发现这4份标本中有2份为抗HBe和抗HBc阳性,1份为抗HBc阳性,1份为抗HBs、抗HBc阳性.对HBV DNA的定量测定表明,其含量在50～200 U/ml.结论 现行的2次酶联免疫技术的血液筛查存在HBV漏检,有必要在现有的血液筛查模式中增加抗HBc检测,或增加病毒核酸筛查.     

单人份核酸检测在血液乙型肝炎病毒筛查中的应用

目的 通过对血液标本的核酸和血清学的检测(NAT)结果进行比较分析,从而探讨核酸检测在血液病毒筛查中的作用.方法 对血液标本进行血清学和核酸检测.使用诺华诊断血液筛查系统对标本进行单人份核酸检测.如标本核酸检测为阳性,则需要对标本进行鉴别;鉴别结果为HBV DNA标本,采用电化学发光法进一步检测乙型肝炎血清标志物五项.结果 10 127例血液标本中检测出NAT(+)标本30例,其中NAT(+)、ELISA(-)的标本12例,ELISA漏检率为1.18‰,鉴别后有6例标本为HBV DNA(+)、ELISA(-),乙型肝炎血清标志物五项为全阴性或抗-HBc(+),未检出HIV RNA或HCV RNA;另有7例标本为NAT(-)、ELISA双试剂(+),其中3例为HBsAg(+),4例为抗-HCV(+).结论 核酸检测可以有效降低酶联免疫法漏检造成的输血风险,但其也存在漏检的情况,因此核酸检测和血清学检测相结合可作为血液筛查检测中的重要手段.     

HBV-DNA-pre-C区(nt1896)变异的临床调查与分析

目的 探讨近一年里乙型肝炎患者感染HBV-pre-C区段变异病毒株的形式并分析其意义。方法 以PCR-酶免定量检测方法检测乙肝“两对半”测定模式为HBsAg(+)及抗-HBc(+)的60例及“大三阳”、“小三阳”各20例患者血清中HBV-per-C区段变异(nt1896变异)的阳性比例,并同时检测ALT的活性。以体检健康者30例为检测对照。结果 HBsAg(+)及抗-HBc(+)的检样组血清中有32例呈HBV-pre-C区段变异(nt1896变异)阳性,阳性率为53.3％,显著高于“大三阳”(4/20)病例及正常对照组(P<0.01),而与“小三阳”组变异阳性率(11/20)没有显著性差异(P>0.05),32例变异阳性中有30例伴有血清ALT活性病理性增高,比率为93.7％;4例“大三阳”变异阳性者均伴有血清ALT活性的病理性增高(100％);而11例“小三阳”变异阳性者中9例(81.8％)伴有血清ALT活性的病理性增高,三组病例变异阳性伴血清ALT活性增高率间没有显著性差异(P>0.05)。结论 HBeAg(一)的乙型肝炎较容易发生HBV-pre-C区段(nt1896)变异,应引起临床诊断及治疗的足够重视。同时也可反映该地区急、慢性乙型肝炎病原感染的部分特征。     

血清HBV标志物、前S2抗原与HBV DNA检测结果的相关性

目的探讨HBV血清标志物、前S2抗原（HBV PreS2-Ag）与HBV DNA的相关性。方法对乙肝患者分别进行五项HBV血清标志物、前S2抗原的检测,同时采用PCR法检测HBVDNA的含量。结果大三阳组前S2抗原（＋）检出率和HBV DNA阳性检出率均高于小三阳组．且与小三阳组比较差异均有统计学意义;前S2抗原（-）组血清HBV DNA检出率为86．90％;前S2抗原（＋）组与血清HBV DNA的差异有统计学意义（P〈0．01）。结论在HBV血清标志物、前S2抗原与HBV DNA检测中联合应用两种方法,可提高检出率．为判断HBV复制和传染性以及指导临床治疗提供更可靠的实验依据。     

前S1抗原与乙肝病毒标志物关系的研究

目的 探讨HBV血清标志物与乙肝病毒前S1抗原（Pre-S1Ag）检测结果的关系。方法应用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测610患者的常规乙肝病毒血清标志物和乙肝病毒前S1抗原。结果本组HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、抗-HBcAg（＋）血清样本226份,Pre-S1Ag阳性检出率为85．84％;HBsAg（＋）、HBeAg（＋）血清样本45份,Pre—S1Ag阳性检出率为93．33％;HBsAg（＋）、抗-HBeAg（＋）、抗-HBcAg（＋）血清样本298份,Pre—S1Ag阳性检出率为44．97％;HBsAg（＋）、抗-HBcAg（＋）血清样本41份,Pre—S1Ag阳性检出率为70．73％。HBeAg（＋）组Pre—S。Ag检出率为87．08％,HBeAg（-）组Pre—S1Ag检出率为35．80％,两者比较差异均具有统计学意义（P〈0．05）。抗-HBcAg（＋）组Pre·S1Ag检出率为64．50％,抗-HBcAg（-）组Pre-S1Ag检出率为82．55％,两者比较差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论Pre-S1Ag是HBV复制的可靠指标,与乙肝标志物联合检测可相互补充。     

乙型肝炎两对半和HBV DNA定量检测的临床应用

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）免疫标志物（HBV-M）与HBVDNA之间的相互关系,为临床诊断、治疗乙型肝炎提供有价值的判断标准。方法用时间分辨荧光免疫法（TRFIA）定量检测HBV-M,并与荧光定量聚合酶链反应检测HBVDNA相比较。结果105例乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗体（抗-HBe）、乙型肝炎核心抗体（抗—HBc）均为阳性;85例HBsAg、HBeAg、抗-HBc均为阳性;34例乙型肝炎病毒抗体（抗-HBs）、抗-HBe、抗HBc阳性组中HBVDNA的检出率分别为65．7％、95．5％和11．7％。以HBsAg含量为100ng／mL作为HBV复制的诊断限,其特异性和敏感性分别是70．0％和84．0％。结论TRFIA定量检测HBV-M灵敏度高、特异性强、操作简便,无放射性污染,是一种较好的HBV-M测定方法,在实验室不具备HBVDNA定量测定的条件下,选择TRFIA进行乙型肝炎两对半定量检测也是一种较好的方法。     

青岛地区无偿献血者乙型肝炎病毒感染血清学和病毒特征分析

目的 分析青岛地区无偿献血者乙型肝炎病毒感染的血清学及病毒学特征.方法 采用常规的血清学试验和核酸扩增技术对本地区315 520份无偿献血者标本进行联合筛查,对HBsAg-/HBV DNA+标本进行高精度病毒载量检测和补充乙肝5项检测,采用PCR直接测序法获得标本中HBsAg编码基因即S基因序列,分析病毒基因型别及氨基...     

Hepatitis B virus DNA in blood donors with anti-HBc as a possible indicator of active hepatitis B virus infection in Yucatan, Mexico

Hepatitis B virus (HBV) may be present in serum even when negative for HBV surface antigen (HBsAg). If routine screening of sera for anti-HBV core antigen (anti-HBc) is not done, low-level HBV viraemia may not be identified. A study was done on the presence of HBV DNA in serum samples from Mexican blood donors negative for HBsAg. Sera from 158 volunteer blood donors, negative for HBsAg and anti-HBs, but positive for anti-HBc, were analysed using nested polymerase chain reaction (PCR). HBV DNA was detected in sera from 13 (8.23%) of the 158. Specificity of the PCR-amplified products was corroborated using Southern blot. Single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis showed identical SSCP-banding patterns for all 13 PCR products, suggesting similar cDNA sequences. Occult HBV infection was observed in approximately 8% of anti-HBc only donors. The absence of HBsAg in the blood of apparently healthy individuals may not be sufficient to ensure lack of circulating HBV, and blood containing anti-HBc only may be infectious until proven otherwise.     

HBsAg阳性血清HBV DNA与HBV标志物定量测定的相关性特征

目的分析HBsAg阳性血清HBV DNA与HBV标志物（HBV M）含量之间的量化关系,揭示两种HBVM血清学模式HBV DNA与HBV M含量的相关性特征。方法对225例血清标本采用PE7000型FQ-PCR仪和AXSYM免疫分析仪分别进行HBV DNA和HBVM的定量测定,以HBV M血清学模式进行HBV DNA分组并分析比较各组的相关性及特点。结果HBsAg/HBeAg/抗-HBc阳性模式的HBV DNA含量54.5%分布在107拷贝/ml以上,HBV DNA的C~G组及抗-HBs、HBeAg、抗-HBe的F~G组含量分别与A组比较差异有统计学意义,且HBV DNA含量与抗-HBs呈负相关（r=-0.670）、与HBeAg和抗-HBe则呈正相关（r=0.524、r=0.814）;而HB-sAg/抗-HBe/抗-HBc阳性模式的HBV DNA含量82.2%分布在105拷贝/ml以下,HBV DNA的B~G组分别与A组比较差异有统计学意义,且仅与抗-HBs呈负相关（r=-0.569）。结论不同HBV M血清学模式HBV DNA与HBV M含量之间存在不同的相关性特征。