不同培养条件对神经干细胞分化的影响

目的:观察在不同血清浓度的诱导条件下神经干细胞定向分化为两类不同神经细胞的情况。方法:通过无血清培养的方法,将原代培养所获得的神经干细胞克隆经传代纯化后,分别接种在加入NeuralBasal,DMEM/F12+50g/L胎牛血清以及DMEM/F12+100g/L胎牛血清3种不同的培养基的培养皿中,7d后进行NF-200,GFAP免疫双标染色,在显微镜下随机选取20个视野,记数神经元和胶质细胞的比例。并进行统计学处理。结果:在无血清、50g/L以及100g/L胎牛血清浓度下,神经元与胶质细胞的比例分别为:65%:35%,45%:55%,33%:67%。在无血清和低血清浓度下,所分化的胶质细胞为原浆型星形胶质细胞,而在高血清浓度下则分化为纤维型星形胶质细胞。结论:血清浓度的高低决定了神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例,并且对所分化的胶质细胞的种类也有影响。在无血清条件下神经干细胞趋向于向神经元分化。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数1O％胎牛血清的DMEM,F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestir。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6．0％-7．0％;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37．9％。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型B微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度选择

目的：探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下，不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响。 方法：实验于2007—08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠1只，由中国医科大学实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供：（多实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，剪碎后胰蛋白酶消化，过滤、离心、弃上清，加入含2％B27、20μg／L表皮生长因子、20μg／L碱性成纤维生长因子的DMEM／F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞，传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养，100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液，稀释后滴加于96孔板内，设立两组，全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM／F12无血清培养基100μL，半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1／2DMEM／F12无血清培养基100斗L。（劲实验评估：观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况。对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0，50，100，150，200μg／L组，各组均加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1的胎牛血清，1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色，检测神经干细胞向神经元分化情况。 结果：①神经干细胞单克隆培养结果：单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢，半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组，随着细胞数的增多，两组细胞增殖速度也相应加快，分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球。②神经干细胞免疫细胞化学染色结果：单克隆培养后克隆球表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达：③各组神经干细胞分化为神经元的比例：与0μg／L脑源性神经生长因子组比较，50，100μg／L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高（t=2．502～5．025，P〈0．05）；而浓度为150，200μg／L时均无明显变化（t=0．420～1．857，P〉0．05）。 结论：向含有B27、表皮生长因子、碱·性成纤维生长因子的DMEM／F12条件培养基中加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1胎牛血清的情况下，脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50μg／L。     

转录调控因子Shh促进胎鼠脊髓神经干细胞体外增殖的效应

目的：观察体外转录调控因子Shh对脊髓神经干细胞的增殖效应，探讨其在脊髓损伤中可能的应用。方法：以一定含量的Shh处理原代和传代的脊髓神经干细胞，分别在接种细胞后的第2，4，6天计数神经球的形成情况；并用胎牛血清作分化诱导剂，观察Shh中干细胞球的分化情况，8d后，免疫组化双标鉴定并计数神经微丝-200(NF-200)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的比例，对比碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作统计学分析。结果：Shh(5～50nmol／L)在体外可以促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖，且表现为剂量依赖性，Shh(50nmol／L)的增殖效应几同bFGF(20μg／L)；增殖的细胞可分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，其神经元与星形胶质细胞的比例同bFGF组的分别为64％：36％和63％：37％。结论：Shh(5～50nmol／L)在体外可以剂量依赖性的促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖，且增殖的细胞具有多分化潜能，其分化细胞的趋向类似于bFGF组。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养**

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清 DMEM 培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物 nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU 掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在.目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧（体积分数21%O2）或低氧（体积分数3%O2）环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12＋1 μg/L胶质源性神经营养因子.结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟.说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元.     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景:有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。目的:观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。方法:体外分离培养孕12d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1μg/L胶质源性神经营养因子。结果与结论:低氧环境下分化10~12d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

骨髓源性神经样细胞体外存活、增殖的特性

目的:寻找骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样/星形胶质样细胞的有效方法,并评价其体外存活和增殖特性。方法:实验于2005-07/2006-08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。采用贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。收集第5代骨髓间充质干细胞单细胞悬液,以1×109L-1置入6孔培养板中,加入DMEM 20%胎牛血清生长培养基,24h后更换生长培养基为DMEM/F12 2?7 40μg/L碱性成纤维生长因子 20μg/L内皮生长因子诱导分化培养基,诱导10～20d,即采用多因子分阶段逐步诱导方法定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经前体样细胞。更换诱导分化培养基为DMEM/5%胎牛血清生长培养基,分两组进行诱导:一组向神经元样诱导分化:全反式维甲酸连续加样,首次浓度0.5μmol/L,以后每天全量加样;二组向星形胶质样细胞诱导分化:10μg/L血小板衍生生长因子BB首次加样,以后每天半量加样,均连续诱导10～14d,进而分化为神经元样/星形胶质样细胞。应用活细胞计数试剂盒CCK-8检测神经元样/星形胶质样细胞的增殖及存活情况,绘制生长曲线及细胞存活曲线。结果:①碱性成纤维生长因子 表皮生长因子连续诱导7d后骨髓间充质干细胞分化为球团样的神经前体样细胞,巢蛋白表达阳性。②全反式维甲酸、血小板衍生生长因子BB分别连续诱导10d后骨髓间充质干细胞逐步分化出神经元样、星形胶质样细胞,并分别表达纤维丝蛋白200及胶质纤维酸性阳性蛋白。③神经元样细胞早期生长较缓慢,具有一定的增殖能力,六七天后达到高峰,此后增殖能力明显下降,细胞存活率明显下降,十四五天之后细胞存活率下降到7.6%以下,难以传代培养。星形胶质样细胞初期生长慢,5d后生长加速,进入对数生长期,七八天后进入平台期,仍保持较高的细胞存活率。结论:采用多因子分阶段诱导方法可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样/星形胶质样细胞。神经元样细胞存活、增殖能力较差,难以传代,星形胶质样细胞存活、增殖能力较强,可建立传代的二倍体细胞系。     

骨髓基质细胞条件培养液通过p38信号转导通路诱导中脑神经干细胞分化

目的：骨髓基质细胞条件培养液能够诱导中脑神经干细胞分化为高比例神经元，但具体机制尚不十分清楚。选择p38信号转导通路作为观察切入点，剖析其在诱导分化途径中所扮演的角色。方法：实验于2006—04／2007—03在河北省脑老化与认知神经科学实验室完成。①实验方法：将SD大鼠麻醉后处死，分离股骨和胫骨，冲洗骨髓腔，将洗出的细胞悬液离心，悬浮后接种，培养48h后弃去未贴壁细胞，更换新的培养基，6d左右可进行传代，约铺满85％瓶底后弃去培养液，更换为含2％B27的Neurobasal培养液，24h后经过离心的上清液即为骨髓基质细胞条件培养液。取新生SD大鼠中脑，机械分散成单细胞后离心弃上清，加入培养液分散过滤，接种时加入含2％B27的DMEM／F12培养基和20μg／L碱性成纤维细胞生长因子，7d左右的单个神经干细胞便可增殖形成球体。将第2-3代神经干细胞球种植于预先包被多聚赖氨酸的培养皿中，贴壁后更换培养液。设立对照组和抑制剂组，均加入骨髓基质细胞条件培养液，此外抑制剂组还加入p38信号转导通路抑制剂SB203580至终浓度4μmol／L。②实验评估：第7天进行免疫细胞化学染色，检测表达微管相关蛋白2的神经元与表达胶质原纤维酸性蛋白的星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例。结果：①神经干细胞分化过程中的形态学变化及p38信号转导通路抑制剂的影响：加入抑制剂后24h，光镜下可见神经干细胞长出的细胞有两种类型：一类细胞体积较小，边缘整齐，立体感强，周围有光晕并在两极有突起，免疫荧光染色显示这类细胞微管相关蛋白2呈阳性表达，即为神经元；另一类细胞突起较粗大，不规则，多聚集在神经干细胞球的中央，呈放射状排列，免疫荧光染色表明这类细胞为胶质原纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。②神经元及星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例：p38信号转导通路抑制剂作用于神经干细胞7d时，从神经干细胞分化成神经元的比例明显低于对照组（P〈0．01），分化成星形胶质细胞的比例明显高于对照组（P〈0．05）。结论：骨髓基质细胞条件培养液在促进神经干细胞分化为神经元的同时，能够抑制其分化为星形胶质细胞，提示骨髓基质细胞分泌的可溶性分子可能是通过p38信号转导通路起作用的。     

体外血清预培养促进神经干细胞增殖

背景：神经干细胞的临床应用前景广阔，寻找多种方法体外促进神经干细胞的增殖和分化为今后的发展方向。目的：介绍一种省时且经济的神经干细胞的培养方法。设计：观察对比实验。单位：北京市神经外科研究所。材料：选择4只孕14天Wistar大鼠，常温常湿环境饲养，体质量（180&;#177;20）g，均购自中国医学科学院动物所（实验动物许可证号码：SCXK1100—0006）。DMEM／F12（1：1）以及B27购自Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购自PeproTech公司；巢蛋白单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体购自Chemicon公司。胎牛血清购自Hyclone公司。方法：实验于2004—05／2004—10在北京市神经外科研究所损伤修复室完成。将Wistar大鼠脱臼处死，每次取4只胎鼠，将其脑组织置于Hank’s液中，解剖显微镜下剥离软脑膜及血管，眼科剪剪碎脑组织并收集细胞于2个离心管中离心，弃上清液。①根据给予血清预培养与否将细胞分成血清预培养组及对照组。血清预培养组细胞加入含100g／L胎牛血清DMEM培养液，培养48h后换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液；对照组细胞中直接加含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液，37℃．体积分数为0．05的CO2培养箱培养1周。通过相差显微镜观察血清预培养组对照组培养48h后神经干细胞的生长情况。②用100g／L胎牛血清诱导分化后的第5天和第10天行nestin、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体免疫荧光染色，采用荧光显微镜观察检测两组神经干细胞的表达；对照组采用PBS缓冲液替代一抗，其它步骤同血清预培养组。主要观察指标：①相差显微镜下观察血清预培养组及对照组神经干细胞培养48h后的生长状况。②免疫荧光染色检测两组神经干细胞的表达。结果：①血清预培养组细胞经培养48h后，出现大量较规则的神经干细胞球，多数细胞球由8-10个细胞聚集而成。改用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液后，细胞球增殖很快；对照组细胞培养48h后只有不规则片状块，4—5d后才出现规则的小细胞球。②荧光显微镜观察可见两组细胞的分化速度和分化方向相同，在诱导分化后的第5天，nestin、胶质纤维酸性蛋白、半乳酸脑苷为阳性，微管相关蛋白2为阴性；在诱导分化后的第10天，nestin和胶质纤维酸性蛋白为阳性，半乳酸脑苷和微管相关蛋白为阴性。结论：血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快，促进神经干细胞增殖。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

正常成人脑脊液诱导人胚来源的神经干细胞分化的实验研究

目的　观察人胚来源的神经干细胞在正常成人脑脊液中的分化情况并探讨其机制。方法　将原代培养的人胚来源的神经干细胞置入含有正常成人脑脊液培养基 (DMEM/F12 +B2 7+ 3 0 %脑脊液 )使其分化 ,在分化的不同时间对分化的细胞进行免疫细胞化学染色 ,计数产生的各类神经细胞的比例。结果　正常成人脑脊液能诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞 ,与其在胎牛血清中的分化相比星型胶质细胞比例增多 (P <0 0 5 ) ,而其他类型细胞比例无显著性差异。结论　正常成人脑脊液能诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞 ,神经干细胞在脑脊液中可以存活和分化 ,为神经干细胞的移植治疗提供有力的依据     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一股以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006—10／2007—03在重庆医科大学完成。材料：新生1～3d的Wistar大鼠全大脑。方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0．10胎牛血清的DMEM／F12培养液诱导其分化。主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经千细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、旱形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的：比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况，探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法：2005-03／09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组：实验分为空白对照组；胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素ld组，后者又分为10μg/L＋100ng/L,10μg/L＋200ng/L,20μg/L＋100ng/L,20μg/L＋200ng/L,1000μg/L＋100ng/L组。②细胞模型制作：用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5&;#215;10^8L^-1接种，悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组：血清终浓度为体积分数为0．1的胎牛血清。细胞接种48h后，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α各组分别加人相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果：①加人胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d，部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α 10μg/L＋100ng／L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L＋200ng／L，20μg/L＋100ng／L，20μg/L＋200ng／L，1000μg/L＋100ng／L组及空白对照组[依次为：（11.70&;#177;0.55）％，（3.62&;#177;0．78）％，（4．14&;#177;0．41）％，（3.3&;#177;0．63）％，（4．92&;#177;0．34）％，（1．61&;#177;0．68）％，P〈0．05或0.01].结论：骨髓基质细胞在体外培养条件下，经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用，配合使用高浓度（体积分数为0．1）血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元；10μg/L＋100ng／L为最佳诱导分化质量浓度。     

骨髓中一类新细胞群--神经组织定向干细胞的确立

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能己得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12,B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd;EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4,β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clonell—5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrep^TM分离液（1．077A）购自Axis-Shield公司。 方法：实验于2004-01／2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrep^TM分离液分离单核细胞层，DMEM／F12（1：1）无血清神经干细胞培养液（内含2％B27，1％N2，20μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，1×10^5U/L青霉素，100mg／L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nesfin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nesfin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15％胎牛血清的     

转录调控因子Shh促进胎鼠脊髓神经干细胞体外增殖的效应

目的:观察体外转录调控因子Shh对脊髓神经干细胞的增殖效应,探讨其在脊髓损伤中可能的应用。方法:以一定含量的Shh处理原代和传代的脊髓神经干细胞,分别在接种细胞后的第2,4,6天计数神经球的形成情况;并用胎牛血清作分化诱导剂,观察Shh中干细胞球的分化情况,8d后,免疫组化双标鉴定并计数神经微丝-200(NF-200)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的比例,对比碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作统计学分析。结果:Shh(5～50nmol/L)在体外可以促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖,且表现为剂量依赖性,Shh(50nmol/L)的增殖效应几同bFGF(20μg/L);增殖的细胞可分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,其神经元与星形胶质细胞的比例同bFGF组的分别为64%∶36%和63%∶37%。结论:Shh(5～50nmol/L)在体外可以剂量依赖性的促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖,且增殖的细胞具有多分化潜能,其分化细胞的趋向类似于bFGF组。     

联合神经生长因子诱导小鼠胎肝间充质干细胞向神经外胚层分化

目的：观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力。方法：实验于2004-03／09在暨南大学血液病研究所完成。健康BABL／c小鼠按雌雄2：1的比例合笼过夜，第2天分开并检查。以见到阴栓为怀孕的标准，计为孕0．5d。分离孕13．5d BABL／C胎鼠肝脏，贴壁法收获胎肝间充质干细胞。用以下方案进行诱导：碱性成纤维生长因子（10μg/L 4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L和成纤维生长因子8（10μg/L）4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L、脑源性神经营养因子（10μg/L以及2％的B27 4d。观察诱导细胞的形态学变化。于诱导0,4，12d收获细胞，反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达；免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达。以上实验均重复3次。结果：①形态学变化：经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形。碱性成纤维生长因子诱导3d，胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集，呈神经干细胞样形态。经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进一步诱导后，大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态，极少数细胞呈星形胶质细胞样形态。②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后，表达神经特异性基因：未诱导的胎肝问充质干细胞巢蛋白（nestin神经干细胞特异性）、低分子量神经丝蛋白（神经元特异性）、胶质纤维酸性蛋白基因（星形胶质细胞特异性）表达与看家基因（甘油醛-3磷酸脱氢酶）的比值分别为（0.06&;#177;0.02）,0,0；诱导4d分别为（0．59&;#177;0．11），（0．46&;#177;0．23），（0．20&;#177;0．96）；诱导12d分别为（0．21&;#177;0．07），（0．85&;#177;0．31），（0．13&;#177;0．10）。每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异（P〈0．01）。③经过神经生长因子的顺序诱导，胎肝问充质干细胞表达神经特异性蛋白：未诱导的细胞不表达巢蛋白（神经干细胞特异性）、微管蛋白Tubulin（神经元特异性）以及胶质纤维酸性蛋白（星形胶质细胞特异性）；诱导4d，圆形细胞及细胞团nestin染色阳性，Tubulin阳性细胞为（62．3&;#177;3．5）%，仅有（6．0&;#177;1．6）％的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性；诱导12d，巢蛋白阳性细胞开始减少，Tubulin阳性细胞达（90．3&;#177;1．5）％；胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为（4．7&;#177;1．5）%。诱导12d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4d的细胞相比有统计学差异；而诱导12d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4d的细胞相比没有统计学差异。结论：胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞，诱导结束后，细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin。     

诱导骨髓基质细胞表达神经细胞标记物Nestin,NSE和GFAP:脑源性神经节苷脂定向诱导细胞分化作用的研究

目的：研究脑源性神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞的作用。方法：成年大鼠骨髓基质细胞传代纯化后，分别在无血清、无外源性生长因子、含2％t327的Neurobasal-A培养基及含20％胎牛血清的DMEM培养基中添加脑源性神经节苷脂作为诱导物，观察细胞的形态变化。结果：在无血清、无外源性生长因子、含2?7的Neurobasal-A培养基中，脑源性神经节苷脂能诱导骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞，其形态发生显著变化，胞体逐渐变小、折光性增强，突起逐渐增多、延长，部分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁；诱导第5d免疫细胞荧光染色显示，神经前体细胞标记物Nestin染色阳性，同时部分细胞可见神经元特异性标记物NSE及星形胶质细胞标记物GFAP染色阳性，而少突胶质细胞标记物Nogo-A染色阴性。在含20％胎牛血清的DMEM（高糖）培养基中，脑源性神经节苷脂的这种诱导、分化作用明显被抑制，表现为细胞形态变化不明显，Nestin、NSE及GFAP染色均为阴性。两组对照组细胞形态无变化、上述染色均为阴性。结论：脑源性神经节苷脂具有诱导骨髓基质细胞成为神经前体细胞的作用，这种作用不需要外源性生长因子存在，血清可抑制这种作用，脑源性神经节苷脂在成体干细胞可塑性研究中有重要价值。