PPARγ通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向成骨细胞
分化的影响,并通过调节PPARγ信号通路开闭影响这一分化过程。方法以大鼠BMSCs作对象,以回转器模拟微重力效应。
将细胞随机分为5组,包括实验组：模拟微重力组、模拟微重力+10 μmol/L吡格列酮组、模拟微重力+10 μmol/L GW9662组、模
拟微重力+10 μmol/L吡格列酮+10 μmol/L GW9662组;对照组：正常重力组。体外成骨诱导14 d后,利用茜素红进行成骨结节
染色、油红-O进行脂肪细胞染色,并计算成脂率;测定各组细胞ALP活性;利用RT-PCR技术检测各组细胞PPARγmRNA表达水
平。结果吡格列酮明显抑制BMSCs向成骨细胞分化,GW9662通过抑制PPARγ的激活而增加BMSCs向成骨细胞分化。结
论推测PPARγ信号通路的激活是模拟微重力条件下抑制BMSCs向成骨细胞分化的主要因素之一,而通过抑制这条通路的激
活可以有效预防及治疗失重导致的骨质疏松症。
     

精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究

背景 研究发现衰老兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力减弱,而精脒(Spermidine)对衰老相关疾病具有保护作用.目的 探讨精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其作用机制.方法 复苏BMSCs并将其分为3组:对照组(Vehicle,培养基中不加入药物),D-半乳糖诱导衰老组(D-gal,培养基中加入40 g/L D-gal诱导BMSCs衰老),Spermidine干预组(Spermidine,培养基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine处理BMSCs).试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与还原型NAD+(NADH)比例,MTT法检测细胞增殖活性.成骨诱导培养后,Western blot检测Sirt1蛋白的表达,qPCR检测成骨相关基因的转录水平.结果 与Vehicle组相比,D-gal组细胞内NAD+/NADH比例降低,BMSCs增殖减弱(P<0.05);Spermidine可提高细胞内NAD+/NADH比例并促进BMSCs增殖(P<0.05).成骨诱导培养后,D-gal抑制Sirt1表达并下调成骨相关基因Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05);而Spermidine可上调Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05).当采用siRNA抑制Sirt1表达后,Spermidine上调成骨相关基因转录表达的作用明显减弱(P<0.05).结论 Spermidine可通过激活Sirt1促进衰老兔BMSCs成骨分化.     

Sdccag3通过Wnt通路对高脂血症大鼠种植体骨结合的影响

目的 探讨Sdccag3在高脂环境中通过Wnt信号通路影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂成骨分化以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合的能力。 方法 构建高脂血症大鼠模型以及高脂环境培养BMSCs并进行成骨诱导,慢病毒载体过表达/沉默结肠癌抗原3(Sdccag3)的表达,采用RT-PCR、Western blotting、Micro-CT以及硬组织切片HE染色、油红O染色、免疫荧光染色等方法检测高脂环境中Sdccag3对大鼠骨代谢以及BMSCs分化平衡的影响。 结果 高脂成骨诱导BMSCs后过表达Sdccag3,下调成脂分化指标脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR-γ),并上调Wnt信号通路标志基因低密度脂蛋白受体相关蛋白 5(LRP5)、LRP6、β-catenin及Wnt5a、Wnt5b,上调成骨分化指标碱性磷酸酶(ALP)、 Runt相关的转录因子2(Runx2);在高脂血症大鼠种植体周围骨组织中,过表达Sdccag3可上调Wnt信号通路标志基因并抑制周围脂形成,沉默LRP5会下调Sdccag3、成骨分化指标,上调成脂分化指标,与沉默Sdccag3表达一致。 结论 高脂血症促进种植体周围脂肪形成并抑制Sdccag3表达;过表达Sdccag3抑制BMSCs成脂分化并降低高脂血症大鼠种植体周围的成脂,促进成骨,促进Wnt信号通路标志基因表达。     

川续断皂苷Ⅵ通过JNK信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

【目的】探讨川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞方向分化的机制。【方法】全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs。实验分为诱导组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+5μmol/L SP抑制组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+10μmol/L SP抑制组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+20μmol/L SP抑制组等5组。采用茜素红染色和骨钙素定量法检测细胞成骨分化程度;采用碱性磷酸酶(ALP)染色测定ALP活性;采用生物信息学方法预测c-Jun氨基末端激酶(JNK)相关因子。【结果】与诱导组比较,1μmol/L续断皂苷Ⅵ组茜素红染色明显增加,ALP活性增强,骨钙素表达量增加(P0.05)。与1μmol/L川续断皂苷Ⅵ组比较,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+5μmol/L SP抑制组、1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+10μmol/L SP抑制组、1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+20μmol/L SP抑制组茜素红染色程度降低,ALP活性减弱,骨钙素含量显著减少(P0.05)。生物信息学表明c-Jun和转录激活因子4(ATF4)、骨形态发生蛋白2(BMP2)之间存在直接的相互联系。【结论】川续断皂苷Ⅵ诱导BMSCs成骨分化的机制可能与JNK信号通路的激活有关。     

原花青素对人牙髓干细胞的增殖及成骨分化作用的研究

目的 探讨原花青素(PAC)对人牙髓干细胞(hDP-SCs)增殖及成骨分化能力的影响.方法 改良组织块消化法分离培养hDPSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,诱导染色鉴定分化潜能.不同浓度的PAC(0、4、8、16、32 μmol/L)刺激hDPSCs后,通过CCK-8法检测hDPSCs的增殖,细胞骨架染色检测hDPSCs的细胞形态,碱性磷酸酶(ALP)活性检测hDPSCs的ALP活性,荧光定量PCR(q-PCR)检测成骨相关基因核心转录因子2 (Runx-2)、骨形成蛋白2(Bmp-2)和Ⅰ型胶原(Col-1)的mRNA表达水平.结果 体外成功培养hDPSCs并进行鉴定;CCK-8检测和细胞骨架染色结果显示,0～16 μmol/L PAC对hDPSCs形态和增殖没有影响,32μmol/L PAC对hDPSCs增殖有抑制作用;ALP染色和定量检测均显示8 μmol/L PAC组ALP活性较对照组(PAC 0μmol/L)高;q-PCR结果显示,与对照组相比,8μmol/L PAC诱导7d后,成骨相关基因Runx-2、Bmp-2、Col-1的表达均升高.结论 PAC对hDPSCs的成骨分化有促进作用.     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3 通路促进BMSCs成骨分化

目的 研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法 应用肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542 (TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果 低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。     

miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用

目的探讨在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,miR-144-3p表达的生理功能和作用机制,并预测其靶基因,为成骨细胞 分化的深入研究提供实验依据。方法采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并在体外诱导间充质干细的成骨分化,通过 qRT-PCR 检测成骨分化标志基因（Runx2, OCN）以及miR-144-3p 的表达;通过向BMSCs 株转染miR-144-3p mimic 以及 miR-144-3p inhibitor,检测miR-144-3p 表达对BMSCs分化的影响,并通过Western blot 以及qRT-PCR检测miR-144-3p 靶蛋 白在RNA水平以及蛋白水平的表达变化。结果在体外诱导BMSCs成骨分化过程中,成骨分化标志基因（Runx2, OCN）的 表达量逐渐升髙,而miR-144-3p 的表达量则逐渐降低,到诱导成骨第21 天表达水平最低;检测各组ALP活性发现,相比于 对照组miR-144-3p mimics 转染组ALP活性显著降低（P<0.05）,miR-144-3p inhibitor 转染组ALP活性显著升高（P<0.05）;运 用多种靶基因预测数据库TargetScan、microRNA.org和miRanda对miR-144-3p进行靶基因的预测分析发现,smad4最可能是 miR-144-3p的靶基因;qRT-PCR结果表明,smad4在各组中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;Western blot结果显示,smad4 在miR-144-3p mimics转染组表达显著下降,在miR-144-3p inhibitor转染组则显著升高,相比于对照组差异均有统计学意义（P< 0.05）。结论miR-144-3p参与调控大鼠BMSCs成骨分化,其抑制成骨分化的功能是通过降低smad4转录后的表达水平来实现。     

鸢尾素对静态和牵张力作用下BMSCs成骨向分化的研究

目的：在静态及牵张力作用下,研究鸢尾素（irisin）对大鼠骨髓间充质基质细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs）成骨向分化的影响。方法：分离培养原代大鼠BMSCs,应用四点弯曲加力系统建立体外细胞牵张模型。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测在静态及牵张力作用下,不同浓度的鸢尾素对BMSCs成骨向分化的影响并筛选最适鸢尾素浓度。实验分组如下：A,对照组;B,鸢尾素组（100 ng/mL鸢尾素）;C,牵张力组（2 000 με牵张力）;D,鸢尾素+牵张力组（100 ng/mL 鸢尾素+2 000 με 牵张力）。细胞计数法检测各组细胞增殖情况,通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）及Western blot检测成骨相关mRNA及蛋白的表达,并检测P38、ERK1/2 MAPK通路表达。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。结果：ALP活性检测结果示,在静态及牵张力作用下,鸢尾素浓度为100 ng/mL时,BMSCs的ALP活性显著升高（P<0.01）。细胞增殖检测结果示,与对照组相比,鸢尾素+牵张力组可促进BMSCs的增殖（P<0.05）。qRT-PCR结果示,鸢尾素+牵张力可促进成骨标志物Runx2、ALP、 COL-Ⅰ、OPN表达的升高（P<0.05）。Western blot结果示,鸢尾素+牵张力可促进Runx2蛋白表达的升高（P<0.05）。此外,鸢尾素+牵张力联合作用促进BMSCs增殖与成骨向分化的机制可能与P38、ERK1/2 MAPK通路的激活有关。结论：鸢尾素对静态和体外牵张力作用下BMSCs增殖及成骨向分化具有促进作用,此效应可能通过P38、ERK1/2 MAPK通路发挥作用。     

Antagomir-30d对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨miR-30d拮抗剂（antagomir-30d）正性调控大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨分化作用并确认转染的最佳浓度。方法：BMSCs培养并分组，分为不同浓度的antagomir-30d（antagomir-30d组）、阴性对照（NC组）和未做转染的BMSCs（空白组）；将不同浓度的antagomir-30d及其NC转染至BMSCs后进行成骨诱导。通过RT-PCR技术进行比较，测定成骨基因碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、Runt相关转录因子2（RUNX2）的mRNA的表达情况，并确定最佳转染浓度及其转染效率。通过ALP染色验证antagomir-30d对成骨分化的调控作用。结果：RT-PCR结果表明，antagomir-30d体外可以促进BMSCs的成骨分化。不同浓度antagomir-30d组的成骨基因表达量随浓度变化而改变，当antagomir-30d转染浓度为150 nmol/L时，ALP、OC、RUNX2的mRNA水平均显著高于空白组和NC组（P＜0.05）。Antagomir-30d的转染最佳浓度为150 nmol/L，此时ALP染色结果显示其活性最高，成骨分化作用好。结论：Antagomir-30d体外正性调控BMSCs的成骨分化，其转染至BMSCs的最佳浓度为150 nmol/L。     

他克莫司对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:研究他克莫司对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的影响。方法:取小鼠BMSC分为3组,低、高剂量他克莫司组分别用含不同浓度(50、500 nmol/L)他克莫司的成骨诱导培养基培养,空白对照组用不含他克莫司的成骨诱导培养基培养。培养3 d,通过CCK-8法检测细胞的增殖能力;培养5、10 d,采用qRT-PCR检测成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osterix)、碱性磷酸酶(Alp)、骨钙蛋白(Ocn)mRNA的表达水平;培养10、14 d,用ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨分化能力。结果:与空白对照组相比,低、高剂量他克莫司组BMSC增殖能力增强,成骨分化相关基因Runx2、Osterix、Alp、Ocn表达上调,ALP活性增强,矿化结节形成增多(P<0.05)。结论:他克莫司可促进小鼠BMSC的增殖和成骨分化。     

不同浓度淫羊藿苷对大鼠脂肪干细胞成骨分化相关因子的体外研究

目的 探究淫羊藿苷对大鼠脂肪干细胞成骨分化的影响。方法 分离、培养SPF级SD雌性大鼠脂肪干细胞后,流式细胞术进行表面标志物检测,然后通过茜素红、油红O染色观察脂肪干细胞的成骨分化及成脂分化。将第3代脂肪干细胞分为空白组、白藜芦醇组(100μmol/L)、淫羊藿苷Ⅰ～Ⅳ组(1、10、50、100μmol/L),培养21 d后对脂肪干细胞LIM结构域蛋白Ajuba(Ajuba)、Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)进行荧光定量RT-PCR、Western-blotting检测。结果 培养至第3代的脂肪干细胞表面标志物表现为CD90(95%)、CD34(9.26%)。成骨诱导21 d时茜素红染色可见橘红色钙化结节,成脂诱导21 d时油红O染色可见红色脂滴。白藜芦醇与100μmol/L淫羊藿苷均能促进脂肪干细胞Runx2、ALP基因及蛋白表达,且与白藜芦醇比较,同浓度的淫羊藿苷呈现出显著的促进效应(P<0.01,P<0.05)。白藜芦醇及各浓度淫羊藿苷均可抑制Ajuba基因及蛋白表达,且与100μmol/L白藜芦醇比较,50、100μmol/L淫羊藿苷抑制A...     

COA: siRNA靶向PPARγ基因重组腺病毒穿梭载体对激素诱导兔骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用

背景：激素是诱发股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的重要原因之一,可导致骨细胞内脂肪沉积而变性坏死从而抑制成骨分化及骨的形成。过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)是一种成脂转录因子,ONFH的发生与PPARγ在骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的高表达有密切关系。BMSCs具有分化为成骨细胞与脂肪细胞的潜能,BMSCs内PPARγ高表达,则BMSCs分化为脂肪细胞。因此,通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）调控PPARγ的表达可抑制BMSCs的脂肪分化,保持MSCs的成骨分化特性。 方法：取新西兰大白兔骨髓,制备兔BMSCs,并随机分6组。S1、S2、S3：干扰1、2、3组,Con：感染无关siRNA组,M：模型组,N：正常组。10-7mol/L地塞米松诱导和siRNA病毒载体感染细胞,倒置显微镜观察BMSCs的形态及生长情况,在第1d、3d、5d、7d时,检测各组BMSCs内PPARγ、osteocalcin和Runx2 mRNA及蛋白的表达。14d时,检测细胞内甘油三酯( triglyceride,TG )含量、细胞培养液中骨钙素(osteocalcin,OC)分泌量和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。21d,苏丹Ⅲ染色BMSCs,并在显微镜下作脂肪细胞计数。 结果：M组和Con组中PPARγ mRNA及其蛋白表达、TG含量和脂肪细胞计数均明显高于N组(P <0.05),而Osteocalcin和Runx2 mRNA及其蛋白表达、培养液中OC含量和细胞内ALP活性明显低于N组(P <0.05)。S1、S2、S3组中PPARγ mRNA及其蛋白表达显著低于M组和Con组(P <0.05),接近N组 (P>0.05),其中S2组的干扰作用最强。 结论：siRNA靶向PPARγ基因腺病毒穿梭载体能够有效抑制激素诱导的BMSCs成脂分化,维持BMSCs成骨分化。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

大黄素通过BMP-9途径促进前体成骨细胞的分化

目的 研究大黄素对前体成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响及其作用机制。方法 采用不同浓度（0.05、0.1、0.5、2.0和5.0 μmol/L）大黄素处理MC3T3-E1细胞（给药组）,以不加大黄素为对照组。分别采用MTT法检测细胞的增殖率;对硝基苯基磷酸二钠（PNPP）法定量检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化结节数目;RT-PCR法检测骨形态发生蛋白（BMPs）途径相关信号分子的表达。采用BMPs抑制剂（Noggin）处理细胞后检测ALP活性,观察BMP-9在大黄素促成骨分化中的作用。结果 大黄素对MC3T3-E1细胞的增殖无影响,大黄素浓度为0.5~5.0 μmol/L时可促进细胞ALP表达及矿化结节形成,其中浓度为5 μmol/L时效果最显著。大黄素可增强细胞BMP-9的表达,与BMP-9信号途径相关的上下游信号分子mRNA的表达亦有相应改变;Noggin预处理后,大黄素促成骨分化的功能受到明显抑制。结论 大黄素可通过激活BMP-9信号通路促进前体成骨细胞的分化。     

塞来昔布对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响

目的 观察不同浓度的塞来昔布对rBMSCs的增殖、成骨诱导分化的影响,探讨塞来昔布影响rBMSCs成骨诱导分化的可能机制。方法 采用全骨髓贴壁法获得rBMSCs;使用不同浓度的塞来昔布（0、12.5、25、50、100μmol/L）干预培养rBMSCs,检测不同浓度的塞来昔布对rBMSCs增殖的影响;采用较高浓度的塞来昔布（100μmol/l）诱导rBMSCs 成骨分化,进行ALP、茜素红染色,应用real-time PCR扩增ALP、OCN。结果 细胞增殖抑制实验表明100μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制明显（P<0.05）;12.5、25以及50μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制无影响。ALP染色结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP染色均为阴性;诱导7天对照组ALP染色为阳性,而实验组染色为阴性;诱导14天对照组ALP染色为阳性,实验组染色阴性。茜素红染色结果表明,成骨诱导3天、7天对照组以及实验组染色均为阴性;诱导至14天对照组染色阳性,实验组染色呈阴性。荧光定量PCR结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP mRNA、OCN mRNA表达均较低;成骨诱导7天对照组ALP mRNA表达明显升高,实验组ALP mRNA表达升高趋势较弱,对照组OCN mRNA表达与第3天相比基本无差异,实验组OCN mRNA表达下降明显;诱导14天对照组ALP mRNA表达出现明显下降,实验组ALP mRNA 表达与第7天相比无明显差异,对照组OCN mRNA表达进一步升高,实验组OCN mRNA表达与第7天相比基本无变化。结论 本实验发现,高浓度的塞来昔布（100μmol/L）对rBMSCs增殖具有显著抑制效应。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程中ALP以及OCN mRNA表达,表明较高浓度塞来昔布抑制rBMSCs成骨诱导分化的效应可能通过抑制ALP以及OCN的基因表达实现,提示在应用NSAIDs时应注意剂量等问题,尤其是应避免使用高剂量甚至是超高生理剂量进行药物镇痛治疗。     

胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响

目的探讨胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响以及机制。方法分离、培养胎鼠颅骨成骨细胞,分别给予不同浓度的胡椒碱处理,采用MTT法检测胡椒碱对成骨细胞毒性的影响;采用碱性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性检测试剂盒检测ALP活性;采用茜素红S染色评估成骨细胞成骨及矿化水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测ALP、I型胶原蛋白α1（COL1A1）、成骨相关转录因子蛋白（OSX）、骨桥蛋白（OPN）、runt相关转录因子2（Runx2）的mRNA表达水平;采用Western blot检测Wnt 1和β-catenin蛋白水平;采用免疫荧光检测β-catenin分布与表达;采用Wnt/β-catenin信号途径特异性拮抗剂IWR-1验证胡椒碱对成骨细胞成骨分化的信号通路。结果在0～60μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱对成骨细胞活力无明显影响（P>0.05）。在0～40μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱呈剂量依赖性促进成骨细胞ALP活性（P<0.01或P<0.001）和矿化结节形成（P<0.05或P<0.01）,促进ALP、COL1A1、OSX、OPN和Runx2的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,促进Wnt 1和β-catenin蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。用IWR-1预处理后,由胡椒碱诱导的成骨细胞的基质矿化受到明显抑制（P<0.01）。结论胡椒碱可通过增强Wnt/β-catenin信号促进成骨细胞的成骨分化。     

黄芩苷对人牙周膜干细胞生物学特性的影响及作用机制

【摘要】 目的 探讨黄芩苷（baicalin）对人牙周膜干细胞（PDLSCs）生物学特性的影响及其潜在的作用机制。 方法 体外培养人PDLSCs,将对数期的PDLSCs随机分为：control组（DMEM培养液）、baicalin组（1.0 μmol/L baicalin）、baicalin+XAV939组（1.0 μmol/L baicalin和4.0 μmol/L Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939）,采用细胞计数法（CCK-8）检测各组细胞增殖情况,黏附实验和Transwell实验分别检测细胞黏附和迁移能力,酶联免疫检测仪检测碱性磷酸酶（ALP）活性,实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测成骨相关基因骨钙蛋白（OCN）,骨桥蛋白（OPN）和成骨细胞转录因子2（RUNX2）的表达,蛋白免疫印迹（Western blot）法分析Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-连环蛋白（β-catenin）、c-myc和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达。 结果 与control组相比,baicalin组PDLSCs增殖能力明显升高,黏附和迁移能力均明显提高,ALP活性随时间的延长而升高,OCN、RUNX2和OPN基因的表达量明显升高,β-catenin、c-myc和Cyclin Dl蛋白表达显著上调,差异均具有统计学意义 (P＜0.05)。与baicalin组相比,添加XAV939能够部分逆转baicalin对PDLSCs以上各指标的影响。 结论 黄芩苷能够促进PDLSCs增殖、黏附和迁移能力,且可诱导PDLSCs的成骨分化,其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞
过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2 的拮抗剂noggin 及Smad1 小干扰
RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt
相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增
高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化
Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到
高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表
达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。
     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。