人胃癌HGC-27细胞及其肿瘤球细胞裸小鼠皮下移植的研究

目的:研究人胃癌HGC-27细胞及其肿瘤球细胞在裸小鼠皮下产生肿瘤的能力。方法:用DMEM培养液(SSM)培养HGC-27细胞。用含有生长因子的DMEM/F12培养液(SFM)在低吸附6孔培养板中诱导肿瘤球的生长。分别将溶于200μL PBS的1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107肿瘤细胞或肿瘤球细胞注射到裸小鼠皮下。常规方法制作组织切片。结果:在SSM培养液中HGC-27细胞呈贴壁、伸展状态生长。在SFM及低吸附的培养条件下观察到了肿瘤球的形成,呈悬浮状态。注射了1×106、1×107肿瘤细胞的裸小鼠产生了移植瘤,注射了1×104、1×105、1×106和1×107肿瘤球细胞的裸小鼠产生了移植瘤。移植瘤组织癌细胞间连接疏松,瘤细胞分化程度低。结论:HGC-27肿瘤球细胞比非肿瘤球HGC-27细胞具有更强的致瘤能力。     

非小细胞肺癌病人源性NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立及比较

目的：构建人非小细胞肺癌的NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型,并探讨移植瘤成瘤性与小鼠品系间的关系,为后续建立优良的动物模型奠定基础。方法：取手术切除获得的23例非小细胞肺癌组织,1 h内移植于NOD/SCID小鼠或BALB/c裸鼠皮下,观察移植瘤成瘤情况,测量移植瘤体积,绘制生长曲线图,计算成瘤率、成瘤潜伏时间和成瘤时间,分析并比较移植成瘤组和未成瘤组所对应患者的相关临床病理指标,并取移植成瘤组和所对应患者的组织标本进行病理学分析。结果：NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率（55.6%）,BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型（20%）,两者间差异无统计学意义（P > 0.05）,但前者的成瘤潜伏时间和成瘤时间均短于后者（P < 0.05）。患者相关临床病理指标中鳞癌、TNM分期和淋巴结转移情况与移植瘤成瘤建模无明显相关（P=0.109、0.153、0.077）,NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型均能保持病人肺癌肿瘤组织的形态学特征。结论：成功构建了NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,NOD/SCID小鼠更适宜用于肺癌病人源性皮下移植瘤模型的建立,非小细胞肺癌移植瘤模型的建立为进行体外抗肿瘤药物的筛选提供了良好的研究工具。     

CD24+CD44+胰腺癌细胞的获取及其干细胞特性的初步鉴定

背景与目的:近年研究发现,肿瘤内存在极小一部分细胞,决定肿瘤的恶性表型及生物学特性,被称为"肿瘤干细胞".本研究拟从人原发胰腺癌组织中找到具有干细胞特性的胰腺癌细胞,为今后靶向干预胰腺癌干细胞,解决胰腺癌治疗的临床难题提供研究基础.方法:将人原发胰腺癌组织种植于NOD/SCID小鼠成瘤,对移植瘤细胞进行流式细胞分选;将流式细胞仪分选获得的细胞用无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养,观察细胞的生长、传代及体外干细胞球形成能力;将细胞接种于非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷型(Nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,观察、比较成瘤率,免疫组化法检测干细胞移植瘤肿瘤分化相关抗原Ki67、CK7及甲基化调控因子MBD1的表达;免疫荧光检测细胞Hedgehog、BMI-1的表达.结果:人原发胰腺癌组织种植于NOD/SCID小鼠可部分成瘤,对移植瘤细胞进行流式细胞分选,获得CD24+CD44+细胞(获得率0.6%～1.8%);将CD24+CD44+细胞用无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养,细胞呈悬浮球状生长,可连续传代并能再次形成干细胞球;将102个CD24+CD44+细胞接种于NOD/SCID小鼠,成瘤率12.5%(1/8小鼠成瘤),将103个CD24+CD44+细胞接种于NOD/SCID小鼠,4周后100%成瘤,而同样数量的CD24 CD44胰腺癌细胞则无法成瘤(P＜0.05),免疫组化法检测干细胞移植瘤中部分细胞表达Ki67、CK7及MBD1阳性;免疫荧光检测证实CD24+CD44+细胞阳性表达Hedgehog、BMI-1,表达量分别高于CD24-CD44-细胞9.95倍和2.74倍(P＜0.05).结论:所获得的CD24+CD44+细胞具有胰腺癌干细胞特性,可作为今后胰腺癌干细胞研究的实验基础.     

胃癌侧群细胞的耐药性及致瘤性的初步研究

目的 从胃癌细胞株中分离并培养侧群（SP）细胞,探讨其耐药性及致瘤性。方法应用流式细胞术从胃癌BGC-823细胞株中分选SP细胞,MTT法观察SP细胞和非SP细胞的增殖情况,流式细胞术检测不同浓度氟尿嘧啶（5-FU）对BGC-823细胞增殖抑制作用以及SP细胞比例、细胞周期情况;通过在NOD／SCID鼠体内种植不同数量的SP细胞和非SP细胞,比较两者的致瘤能力。结果流式细胞仪检测胃癌BGC-823细胞中存在0.9％～2.1％的SP细胞,MTT法显示SP细胞有较强的增殖活性。2.5、5、10和25μg／ml 5-FU作用于BGC-823细胞（2.0×10⁶个）36h后,细胞数分别为2.6×10⁶、2.3×10⁶、2.0×10⁶和1.8×10⁶,SP细胞比例依次为12.9％、9.9％、4.0％和2.1％,SP细胞处于G0／G1期。SP细胞和非SP细胞分别以1×104细胞数接种NOD／SCID鼠,SP细胞形成瘤体的平均瘤重为0.577g,而非SP细胞为0.150g,且SP细胞成瘤时间较非SP细胞短且瘤体数量多、质量高。结论人胃癌细胞系BGC-823中的SP细胞具有较强的增殖活性和类似干细胞的耐药性,针对SP细胞可以为抗肿瘤治疗提供新的靶点。     

人肺癌组织免疫缺陷鼠移植瘤模型的建立

背景与目的：目前提倡对肿瘤实行靶向药物个性化治疗,建立不同通路异常肿瘤的动物模型成为必需。本研究探讨人非小细胞肺癌手术标本免疫缺陷鼠皮下移植瘤模型的建立及建模的适宜条件和方法。方法：选取BALB／c裸小鼠、SCID小鼠及NOD／scid小鼠各16只,采用套管针四点左边两块、右边一块式接种法,16例患者中每例患者的肿瘤组织标本分别接种于每个鼠种的一只。观察不同种免疫缺陷鼠移植瘤成瘤率、成瘤潜伏时间、肿瘤体积倍增时间、自然病亡率及左右两边接种点的成瘤率和头尾部成瘤点处死时大于1cm的比率,并鉴别移植瘤形态结构与来源组织的一致性及鉴定移植瘤是否为上皮来源。结果：总成瘤率为75％,其中4个病例只有SCID小鼠成瘤．2个病例只有BALB／c裸小鼠成瘤,NOD／scid小鼠无一例单独成瘤。不同种免疫缺陷鼠移植瘤成瘤率、成瘤潜伏时间和肿瘤体积倍增时间及左右两边接种点的成瘤率差异无统计学意义。SCID小鼠成瘤率最高,为56．25％;NOD／scid小鼠自然病亡率为25％,BALB／c裸小鼠、SCID小鼠在观察期内无一例病亡;处死时头部成瘤点大于1cm的比率（56．52％）与尾部成瘤点大于1cm的比率（25％）相比差异有统计学意义（P=0．037）;所有移植瘤苏木精．伊红染色显示其形态结构均与来源组织一致,所有移植瘤角蛋白免疫组化均为阳性,显示移植瘤均为上皮来源。结论：四点两块套管针接种BALB／c裸小鼠和SCID小鼠各一只的方法能很好地建立非小细胞肺癌手术标本免疫缺陷鼠皮下移植瘤模型,头部移植瘤的生长速度明显快于尾部。     

银莲花素A对S180、H22和U14细胞小鼠移植瘤的抑制作用

背景与目的:有研究证明,从两头尖中分离得到的三萜皂甙银莲花素A在体外具有较好的抑瘤活性.本研究将观察银莲花素A在体内对小鼠移植瘤的抑制活性.方法:MTT法检测银莲花素A对人鼻咽癌KB细胞和人卵巢癌SKOV3细胞的抑制率.体内实验选取小鼠肉瘤S180细胞、小鼠肝癌H22细胞和小鼠宫颈癌U14细胞.观察银莲花素A注射给药对S180、H22和U14细胞小鼠移植瘤的抑瘤率,以及灌胃给药对小鼠肉瘤S180移植瘤的抑瘤率.测定银莲花素A的急性毒性.结果:银莲花素A在体外对KB细胞和SKOV3细胞的IC50分别为4.64 μg/mL和1.40 μg/mL.4.5 mg/kg银莲花素A腹腔注射对S180、H22和U14细胞小鼠移植瘤的抑瘤率分别为60.5%、36.2%和61.8%.200 mg/kg灌胃给药时抑瘤率为64.7%.灌胃给药和腹腔注射银莲花素A的LD50分别为1.1 g/kg和16.1 mg/kg.结论:银莲花素A在体内外均具有较好的抑瘤作用,体内可抑制小鼠移植瘤的生长,是一个有潜力的抗癌药物.     

人肝癌PLC/PRF-5细胞中干细胞样细胞的分离及其特异性miRNAs的筛选

目的:分选及鉴定人肝癌PLC/PRF-5细胞中的肝癌干细胞样细胞,研究其microRNAs(miRNAs)表达谱。方法:以ABCG2为表面标志,免疫磁珠法分选、流式细胞术检测ABCG2+和ABCG2-PLC/PRF-5细胞,观察ABCG2+与ABCG2-PLC/PRF-5细胞的琼脂克隆形成能力和接种NOD/SCID小鼠的成瘤能力。应用miRNA芯片筛选ABCG2+和ABCG2-PLC/PRF-5细胞差异表达的miRNAs,real-time PCR验证部分差异表达的miRNAs。结果:免疫磁珠分选的ABCG2+PLC/PRF-5细胞纯度可达(84.20±4.52)%。ABCG2+PLC/PRF-5细胞比ABCG2-PLC/PRF-5细胞形成更多、更大的克隆集落(47.17±10.50 vs23.33±7.31,P<0.05);NOD/SCID小鼠接种1×104个ABCG2+PLC/PRF-5细胞即可成瘤,而ABCG2-PLC/PRF-5细胞至少需要5×105个才可成瘤;5×105个细胞时,ABCG2+PLC/PRF-5细胞组的肿瘤体积显著大于ABCG2-PLC/PRF-5细胞组[(3.73±1.19)cm3 vs(0.72±0.57)cm3,P<0.01]。ABCG2+PLC/PRF-5细胞和ABCG2-PLC/PRF-5细胞差异表达的miRNAs有20个:上调的13个,下调的7个;real-time PCR验证其中的hsa-miR-30a和hsa-miR-630的差异表达,其结果与miRNA芯片结果基本一致。结论:人肝癌细胞系PLC/PRF-5中ABCG2+细胞具有肿瘤干细胞的特性;ABCG2+和ABCG2-PLC/PRF-5细胞差异表达的miRNAs有20个,它们在肝癌发病中可能起重要的调控作用。     

人肺腺癌A549细胞系SP细胞及非SP细胞亚群生物学特性的比较研究

[目的]探讨人肺腺癌A549细胞系SP细胞及非SP细胞亚群的生物学特性。[方法]用流式细胞仪分选出A549细胞系SP细胞及非SP细胞亚群,检测两种亚群的细胞周期各时相分布,并进行侵袭和迁移实验以及裸鼠移植瘤实验来研究两亚群细胞的生物学特性;HE染色验证移植瘤组织类型;用RT-PCR及免疫组化方法检测A549细胞系和移植瘤中ABCG2表达情况。[结果]免疫组化检测A549细胞系ABCG2阳性表达率为2%。两亚群细胞的细胞周期各时相分布及迁移能力相似（P〉0.05）,而SP细胞的侵袭能力则大于非SP细胞的侵袭能力（P〈0.05）。SP细胞1×105和1×104数量级在接种裸鼠3~8周后观察到移植瘤形成,而非SP细胞亚群只有1×107数量级在接种4周后出现移植瘤;移植瘤组织类型为腺癌;RT-PCR及免疫组化方法检测移植瘤均观察到ABCG2呈阳性表达。[结论]人肺腺癌A549细胞系中的SP细胞亚群较非SP细胞亚群具有强大的侵袭和致瘤能力。     

无血清培养法分离并鉴定胰腺癌细胞系BxPC-3中肿瘤干细胞

[目的]从人胰腺癌细胞系BxPC-3中分离并鉴定胰腺癌干细胞。[方法]用无血清培养基培养人胰腺癌BxPC-3得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,观察各传代后细胞成球能力;并用含血清培养基诱导促使其分化;蛋白印迹法测定肿瘤干细胞特异性转录因子OCT-4蛋白表达情况,并将肿瘤细胞球细胞植入NOD/SCID小鼠皮下,观察移植瘤的形成。[结果]在无血清培养基中,BxPC-3细胞能形成少量肿瘤细胞球,具有很强的自我更新能力,成球能力随着球体细胞传代次数的增加而增加。在含血清环境中,球体细胞逐渐分化而呈贴壁生长。肿瘤细胞球OCT-4蛋白表达明显高于BxPC-3贴壁细胞。1×104个球体细胞即能在NOD/SCID小鼠皮下成瘤。[结论]无血清培养能够有效的分离和扩增人胰腺癌细胞系BxPC-3的肿瘤干细胞。     

NOD/SCID小鼠平台上的肿瘤实验研究进展

非肥胖糖尿病／严重联合免疫缺陷（non-obese diabetes—SCID mice，NOD／SCID）小鼠具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷、NK细胞活性低下、无循环补体、巨噬细胞和抗原提呈细胞功能损害等特性，近年已成为人类肿瘤移植瘤的最佳研究模型。NOD／SCID鼠的人类血液系统肿瘤模型能够研究造血微环境、白血病细胞的分化调控机制和潜在的治疗靶点，并且建立在此平台上的体内药敏实验，可以指导临床化疗方案设计，目前已显示出突出的疗效。乳腺癌等实体瘤原代肿瘤组织的移植瘤模型，也显示出可复制人类肿瘤特点的优势。此外，NOD／SCID鼠可进行肿瘤干细胞的筛选和鉴定，并寻找针对肿瘤干细胞的特异性治疗靶点。目前的研究已展现了NOD／SCID鼠在肿瘤研究领域的广阔前景。     

Biomarkers in clear cell renal cell carcinoma

The treatment of advanced renal cell carcinoma (RCC) has evolved significantly following the identification of the von Hippel–Lindau (VHL) gene and the function of its protein, and subsequent development of antiangiogenic therapies. A series of clinical trials resulted in the approval of three new agents with significant activity in this disease. Additional studies are now underway to identify subsets of patients most likely to benefit. This article reviews the current therapy for advanced RCC and the development of biomarkers in RCC. This requires the identification of disease characteristics at a clinical, genetic and molecular level associated with response and/or surrogate measures of clinical benefit. Currently, a variety of prognostic factors (lactate dehydrogenase, performance status, disease-free interval, hemoglobin and calcium levels) are utilized to predict the survival of RCC patients. The use of validated biomarkers in either serum/plasma, urine or tissue could enhance this process, as well as define at the molecular and genetic levels, factors associated with response to therapy and/or the development of resistance. Examples include plasma VEGF levels, VHL gene mutation status and carbonic anhydrase IX levels in tumor tissue, among others. Validation of such biomarkers is crucial in order for them to be clinically useful.     

Biomarkers in clear cell renal cell carcinoma

The treatment of advanced renal cell carcinoma (RCC) has evolved significantly following the identification of the von Hippel-Lindau (VHL) gene and the function of its protein, and subsequent development of antiangiogenic therapies. A series of clinical trials resulted in the approval of three new agents with significant activity in this disease. Additional studies are now underway to identify subsets of patients most likely to benefit. This article reviews the current therapy for advanced RCC and the development of biomarkers in RCC. This requires the identification of disease characteristics at a clinical, genetic and molecular level associated with response and/or surrogate measures of clinical benefit. Currently, a variety of prognostic factors (lactate dehydrogenase, performance status, disease-free interval, hemoglobin and calcium levels) are utilized to predict the survival of RCC patients. The use of validated biomarkers in either serum/plasma, urine or tissue could enhance this process, as well as define at the molecular and genetic levels, factors associated with response to therapy and/or the development of resistance. Examples include plasma VEGF levels, VHL gene mutation status and carbonic anhydrase IX levels in tumor tissue, among others. Validation of such biomarkers is crucial in order for them to be clinically useful.     

Non-small and small cell lung carcinoma cell lines exhibit cell type-specific sensitivity to edelfosine-induced cell death and different cell line-specific responses to edelfosine treatment

The unique signal transduction pathways that distinguish non-small cell lung carcinoma (NSCLC) from small cell lung carcinoma (SCLC) are poorly understood. We investigated the ability of edelfosine, an inhibitor of phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PLC) to inhibit cell viability among four NSCLC cell lines and four SCLC cell lines. The differential sensitivity of cells to edelfosine's cytostatic and cytotoxic effects has been attributed to edelfosine-induced changes in the activities of many enzymes, including c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), extracellular signal-regulated kinases (ERK), p38 kinase, and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). To investigate the role of these enzymes in edelfosine-induced cytotoxicity, we correlated edelfosine-induced changes in enzyme activity and cell viability among the different NSCLC and SCLC cell lines. We found that NSCLC cells are much more susceptible to the cytotoxic effects of this drug than are SCLC cells. Three out of the four edelfosine-sensitive NSCLC cell lines (NCI-H157, NCI-H520, NCI-H522) exhibit G2/M arrest, significant apoptosis and some degree of JNK activation in response to drug treatment. In contrast, none of the SCLC cell lines exhibit edelfosine-induced G2/M arrest or significant apoptosis. A comparison of the edelfosine-induced effects among the sensitive and resistant lung cancer lines indicates that there is little correlation between edelfosine-induced cytotoxicity and altered activities of JNK, ERK, p38, or cleavage of PARP. These results demonstrate that edelfosine-induced changes in JNK, ERK, p38, or PARP are not good predictors of cell susceptibility to edelfosine-induced cytotoxicity. Thus, edelfosine-induced inactivation of PLC may disrupt signaling cascades downstream of PLC that are unique to individual cellular environments. These findings also identify edelfosine as one of the few potential chemotherapeutic agents that has a greater cytotoxic effect against NSCLC cells than SCLC cells.     

桥接整合因子1通过AKT-mTOR通路诱导非小细胞肺癌H1975细胞周期阻滞

目的：研究桥接整合因子1（bridging intergrator 1,Bin1）基因过表达后对非小细胞肺癌细胞株H1975细胞周期的影响及其作用机制。方法：构建携带Bin1基因的CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin-Bin1质粒,并转染H1975细胞（Bin1+组）,另设置空白质粒转染组（Bin1-组）及空白对照组（Ctrl组）,利用RT-PCR和Western blotting分别检测3组细胞中Bin1在mRNA和蛋白质水平的表达情况。流式细胞术检测不同处理组H1975细胞周期的变化,Western boltting分别检测各组中AKT、mTOR磷酸化水平及细胞周期相关蛋白（周期蛋白D1、CDK4、Rb）的表达情况。结果：与Bin1-组、Ctrl组比较,Bin1+组H1975细胞中Bin1在mRNA、蛋白水平表达明显上调（均P<0.05）; H1975细胞阻滞在G1期\[（60.53±1.89）% vs（46.14±1.56）%、（47.33±2.07）%,均P<0.05\]; Bin1+组H1975细胞内p-AKT、p-mTOR表达下调（均P<0.05）,AKT、mTOR表达变化无统计学差异（P>0.05）;周期蛋白D1、CDK4的表达量均明显下调(P<0.05),Rb表达量明显增加（P<0.05）。结论：Bin1基因在H1975细胞株过表达后明显诱导细胞周期阻滞,其机制可能是通过抑制AKT-mTOR通路及其细胞周期相关蛋白实现的。     

A human squamous cell carcinoma cell line.

An epithelial cell line COLO 16 has been established from a human squamous carcinoma, characterized and maintained for over two years. The cells produce a parathyroid-like hormone and carcinoembryonic antigen. The line is definitely not a "HeLa contaminant." The cell line is available to other investigators.