转录活化蛋白在人肾小球系膜细胞表达金属蛋白酶组织抑制物1中的信号转导作用

目的 探讨凝血酶对体外培养的人肾小球系膜细胞表达基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）的影响以及信号转导录活化蛋白（STAT）信号转导途径对这一过程的介导机制。方法 分离提取细胞总RNA,进行TIMP1的Northern杂交分析,制备细胞核蛋白提取物,应用凝胶阻滞试验酸转染技术进行阻断分析。结果在体外培养的人系膜细胞,基础状态下可以表达一定水平的TIMP1 mRNA和STAT－DNA结合活性。不同浓度凝血酶（0．5,1．5,4．5U／ml)后TIMP1 mRNA转录水平分别是对照组的4,1．4和3．7倍。在凝血酶作用下,细胞TIMP1 mRNA表达水平与STAT－DNA结合活性呈一致性变化,凝血酶特异性抑活物－水蛭素可同时抑制IMP mRNA表达水平及STAT－DNA结合活性;细胞转染STAT1和STAT3反义寡苷酸后在降低STAT－DNA结合活性的同时,阻断凝血酶对TIMP1 mRNA表达的诱导作用,结论 STAT参与了解诱导人肾小球系膜细胞TIMP1的基因表达过程。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

稳定表达淋巴细胞趋化因子的大鼠系膜细胞载体的构建

目的 探讨以肾小球系膜细胞作为高表达大鼠淋巴细胞趋化因子(Lm)的载体的可行性，从而为深入研究淋巴细胞趋化因子的作用和体内活性创造条件。方法 采用RT-PCR法获得大鼠的Ltn的编码区全长的cDNA序列；应用基因重组技术和限制性内切酶酶切法构建并鉴定pcDNA3．1／Lm真核表达载体；用LipofectAMINEPUUS脂质体转染法将构建的质粒及空质粒瞬时转染于SKOV3细胞；用RT—PCR和ELISA法检测Ltn mRNA及蛋白质水平的表达，进而用pcDNA3．1／LacZ和pcDNA3．1／Ltn稳定转染原代培养的WKY大鼠肾小球系膜细胞，用潮霉素B筛选获得稳定表达报告基因LacZ和大鼠Ltn的细胞克隆。结果 测序结果显示质粒载体中正确地插入了大鼠Lm的编码基因；RT-PCR显示在瞬时转染的SKOV3细胞和稳定转染的4个系膜细胞克隆中Ltn mRNA表达增高；ELISA证实细胞培养上清中Ltn的蛋白质浓度较对照组明显升高。此外，X-gal染色显示获得了2个稳定表达β-半乳糖苷酶基因的系膜细胞克隆。结论 本研究成功地构建了真核表达质粒载体pcDNA3．1／hygro／Ltn，获得了稳定表达大鼠Lm的肾小球系膜细胞克隆，并在mRNA及蛋白质水平上证实了Lm的表达，为进一步研究Lm的体内活性奠定了基础。     

反义细胞周期素D1基因转导肾小球系膜细胞

建立外源基因转导肾小球系膜细胞的基因转移系统，为系膜增殖性肾小球疾病的机制和治疗研究提供条件。方法：利用基因重组技术构建反义CyclinD1逆转录病毒表达载体，重组体经Lipofectin转染第3代包装细胞，建立了能持续分泌假病毒颗粒的无性细胞系，重组病毒经DEAE-葡聚糖转导肾小球系膜细胞，并对系膜细胞转录表达CyclinD1反义RNA水平进行原位杂交分析。结果：建立的无性细胞系上清中病毒滴度达1×10~6CFU／ml以上；假病毒重组体成功转导系膜细胞，并高效表达CyclinD1反义RNA。结论：该逆转录病毒载体基因转移系统能很好地适用于系膜增殖性肾小球疾病的间接体内基因治疗研究。     

反义转化生长因子β1基因对大鼠肾系膜细胞FN和PAI-1分泌的影响

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染反义转化生长因子β1基因(TGF-β1),观察该细胞纤维连接蛋白(FN)及1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的改变。方法构建反义TGF-β1基因真核表达载体,采用脂质体进行基因转染MsC,用ELISA法检测转染系膜细胞上清液中FN和PAI-1的蛋白质水平,并与无转染的MsC对照组和空载体组比较其表达的变化。结果构建了大鼠反义TGF-β1基因真核表达载体,并将其转染Msc,与对照组相比转染48小时后细胞分泌FN和PAI-1蛋白质水平明显下降(P<0.05)。结论反义TGF-β1基因真核表达载体可从分子水平阻断MsC的FN及PAI-1表达,在肾小球硬化及肾小球肾炎的研究治疗中有一定的应用价值。     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。     

反义细胞周期素D1基因转导肾小球系膜细胞

目的：建立外源基因转导肾小球系膜细胞的基因转移系统，为系膜增殖性肾小球疾病的机制和治疗研究提供条件。方法：利用基因重组技术构建反义Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１逆转录病毒表达载体，重组体经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染第３代包装细胞，建立了能持续分泌假病毒颗粒的无性细胞系，重组病毒经ＤＥＡＥ－葡聚糖转导肾小球系膜细胞，并对系膜细胞转录表达Ｃｙｌｉｎ Ｄ１反义ＲＮＡ水平进行原位杂交分析。结果：建立的无性细胞系上清中病     

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白L23（RPL23）编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR，以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系。方法 按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列。PCR产物经DNA序列测定证实后，通过双酶切，将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )K ，酶切电泳鉴定。采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1( )-RPL23转染SGC7901细胞，pcDNA3.1（＋）－anRPL23转染SGC7901／VCR细胞，经G418筛选后，随机挑选细胞克隆。通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23 mRNA表达水平的变化。结果 应用RT－PCR反应扩增获得大小约0.5kb的特异性片段。经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致。重组正义真核表达载体pcDNA3.1( )-RPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段；重组反义真核表达载体pcDNA3.1( )-anRPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段，均与预期结果相符。转染细胞经筛选后，随机挑选，扩增了2个细胞克隆，斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降，而正义转染后其表达水平明显增加。结论 成功克隆了人RPL23编码基因序列，并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中得到稳定转染细胞株，正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

Cyclin D3正、反义表达质粒在淋巴瘤细胞系Raji中的转染与鉴定

目的 :构建人类cyclinD3正义和反义真核表达质粒 ,分别转染到淋巴瘤细胞系Raji细胞中 ,为探讨cyclinD3基因对淋巴瘤细胞生物学行为的影响提供研究基础。方法 :以Raji细胞总RNA为模板 ,通过RT -PCR获取cyclinD3全长cDNA ,克隆入 pGEM -T载体 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,构成含cyclinD3的表达质粒 pcD NA3 -cyclinD3。再运用DNA重组技术将cyclinD3基因反向克隆到pcDNA3 .1中 ,构建成cyclinD3反义表达质粒pcDNA3 -ascyclinD3。用脂质体介导的基因转染方法 ,将cyclinD3正、反义表达质粒和空质粒分别导入Raji细胞 ,经G418筛选建立稳定转染细胞株 ,用WesternBlot方法鉴定cyclinD3基因的表达。结果 :酶切鉴定和测序分析证实 ,实验成功构建了cyclinD3正、反义表达质粒。与转染cyclinD3正义表达质粒和空质粒的细胞相比 ,转染cyclinD3反义表达质粒的Raji细胞中cyclinD3表达水平下降。 结论 :正、反义cyclinD3在淋巴瘤细胞中的转染和表达 ,为进一步研究cyclinD3在淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用奠定了基础     

TIMP-3基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用

目的: 构建组织基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)真核表达载体并转染乳腺癌MDA-MB-453细胞,探讨TIMP-3对MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用。 方法: 采用RT-PCR法从人新鲜胎盘组织中获得TIMP-3 cDNA,连接至pMD18-T载体,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切pMD18-T-TIMP3重组质粒及pcDNA3.1载体并连接,构建pcDNA-TIMP-3真核载体,酶切鉴定、测序。将乳腺癌MDA-MB-453细胞分为正常对照组、pcDNA空载体组(只转染pcDNA空载体)和pcDNA-TIMP-3组(转染pcDNA-TIMP-3)。Western blotting法测定蛋白表达,采用MTT法和Boyden小室侵袭实验测定各组细胞的增殖活性及侵袭能力。 结果: 重组载体经过EcoRⅠ 和XbaⅠ酶切后,产生633bp的TIMP-3目的片段和pcDNA3.1线性化载体,经自动测序仪测定TIMP-3序列完全正确。转染重组载体后MDA-MB-453细胞稳定表达了TIMP-3,与正常对照组和pcDNA空载体组比较,pcDNA-TIMP-3组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),穿透以Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)和玻璃连接蛋白(VN)包被的Matrigel膜的侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。 结论: 成功构建pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体,可在MDA-MB-453细胞中高表达TIMP-3蛋白,并对MDA-MB-453细胞生长及侵袭性有抑制作用。     

大鼠肾小球系膜细胞活性氧簇JAK2/STAT5通路与TIMP-1之间的关系及对其凋亡的影响

目的:探讨高糖(HG)条件下大鼠肾小球系膜细胞(RMC)活性氧簇(ROS)、JAK2/STAT5信号通路与金属蛋白酶1组织抑制剂(TI MP-1)之间的关系及对其凋亡的影响。方法:在HG培养条件下的RMC中,根据是否使用DPI(NADPH氧化酶特异性抑制剂,可抑制ROS产生)和AG490(JAK2特异性抑制剂)刺激24 h,将RMC分为HG组、HG+AG490组、HG+DPI组和HG+AG490+DPI组四组。采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率,RT-PCR检测各组RMC Bcl-xl、Cyclin D1、P27kip1、JAK2和TI MP-1 mRNAs的表达,Western blot检测胞浆中JAK2、STAT5及相应磷酸化蛋白的表达。结果:HG组、HG+AG490组、HG+DPI组和HG+AG490+DPI组的细胞总凋亡率分别为:(10.69±0.26)%、(20.52±0.51)%、(24.56±0.36)%和(26.01±0.28)%;加入AG490和(或)DPI后RMC总凋亡率明显升高(P<0.01),Bcl-xl、Cyclin D1、JAK2和TI MP-1 mRNAs表达显著减少,P27k...     

Effect of Antisense RNA Targeting Polo-like Kinase 1 on Cell Growth in A549 Lung Cancer Cells

In order to investigate the effect of Polo-like kinase-1 （Plk1） depletion on cell cycle progression and cell growth in lung cancer cells, a recombinant plasmid containing antisense RNA targeting Plk1 （pcDNA3-Plk1） was transfected into A549 cells by lipofectine. RT-PCR and Western-blot were used to detect the Plk1 gene expression. Cell proliferation was evaluated by direct cell counting and bromodeoxyuridine （BrdU） labeling. Cell cycle distribution and apoptosis were examined by flow cytometry, and the inhibition rate （IR） by vinorebline （NVB） was determined by MTF assay. The results showed that after transfection of pcDNA3-Plk1 into A549 cells, the expression levels of Plk1 mRNA and protein were greatly decreased. In pcDNA3-Plk1 transfected groups, abnormal morphological changes of cells and growth inhibition were observed, and the BrdU labeling index was significantly lower than in the control groups （P〈0.05）. Cells in pcDNA3-Plk1 transfected groups were arresed in G2/M phase and apoptosis was detectable 72 h post transfection. IR induced by vinorebline in pcDNA3-Plk1 transfected groups was significantly higher than in other groups. These data suggested that antisense RNA targeting Plk1 could suppress the Plk1 expression, and therefore, significantly inhibit cell proliferation and induce cell cycle arrest and apoptosis. Moreover, it sensitized lung cancer cells to chemotherapy.     

腺病毒介导的反义c-myc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究

目的 构建介导反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞的细胞周期,增殖和凋亡的影响。方法 将ｃ－ｍｙｃ基因反向克隆于穿梭质粒载体ｐＡｄＣＭＶ中,通过脂质体与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,经同源重组产生编码反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒。体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２和ＳＰＣ－Ａ－１以及人胚肺二倍体细胞２ＢＳ后,细胞周期的改变,凋亡的发生和相关基因表达的变化;体内观察对肿瘤     

机械牵张力对血清饥饿诱导的成骨细胞凋亡的作用研究--caspases，bcl-2及bax的差异表达

目的：细胞凋亡参与了机械力作用下骨组织的适应性改建。本研究的目的是观察机械牵张力对体外培养成骨细胞凋亡的影响,并通过检测caspases,bcl-2和bax的表达来探讨其相关机制。 方法：使用Flexcell 4000TM细胞应变加载系统对新生SD大鼠颅顶骨成骨细胞施加不同大小的牵张力,细胞培养于含10%胎牛血清或无血清的MEM培养液中。运用流式细胞技术检测成骨细胞的凋亡,Elisa检测caspase-3活性,Real-time RT-PCR检测细胞caspase-8,caspase-9,bcl-2和bax的基因表达。 结果：在含10% 胎牛血清的培养液中,牵张力对成骨细胞的凋亡无影响。无血清培养时,成骨细胞凋亡率和caspase-3活性增加,同时caspase-9和 bax表达也增加。6%牵张力对无血清培养诱发的成骨细胞凋亡有抑制作用,同时caspase-3活性和caspase-8表达下降,并伴随bcl-2表达升高。而12%牵张力作用于无血清培养的成骨细胞时,细胞凋亡率增加,并伴随caspase-3活性、caspase-8和bax表达升高。Caspase-9的表达在张应变刺激作用下无明显变化。 结论：机械牵张力通过caspase-8引发的caspase级联反应调控成骨细胞的凋亡。轻力上调bcl-2 的表达来抑制无血清诱导的成骨细胞凋亡,而重力通过上调bax的表达促进细胞凋亡。     

红细胞分化相关因子1对人红白血病细胞珠蛋白表达的影响

目的：探讨红细胞分化相关因子（EDRF）1基因在人红白血病（HEL）细胞中珠蛋白表达的影响。方法：构建EDRF1真核正义和反义表达载体,转染HEL细胞并筛选稳定表达细胞克隆。然后利用Northern blot和逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）的方法观察红系标志基因表达水平的改变,应用凝胶阻滞电泳（EMSA）的方法观察红系转录因子DNA结合活性的改变。结果：与对照组相比, EDRF1过表达的HEL细胞中α－珠蛋白合成明显增加,EDRF1反义表达载体转染的HEL细胞中的α-、γ－珠蛋白合成下调,而红细胞生成素（EPOR）表达水平没有明显改变。红细胞特异的转录因子GATA－1和NFE2mRNA的表达在转染前后没有明显改变。GATA－1转录因子的DNA结合活性在反义表达载体染的HEL细胞中受到明显的抑制,而红系核因子（NF－E）2的转录活性则没有明显的改变。结论;EDRF1下调珠蛋白的合成是通过抑制红系特异的转录因子GATA－1的DNA结合活性实现的。     

NHE-1反义基因对胃癌细胞的酸化作用及其意义

目的 探讨Na -H 交换泵-1(Na -H exchanger1,NHE-1)反义基因转染对人胃癌细胞内pH值(intracellular pH,pHi)的调节作用及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法 构建人NHE-1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中, 采用荧光探针检测转染前后细胞内pH值的变化以及对细胞增殖和凋亡的影响.结果 转染反义基因的细胞pHi明显降低,增殖能力降低,细胞凋亡率增加.结论 NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi及增殖和凋亡调节中起重要作用.     

人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人骨唾液酸蛋白（hBSP）正反义真核表达载体，并检测其在骨肉瘤细胞MG-63中的表达。方法 以人骨膜细胞总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出hBSP全长序列，通过DNA重组技术构建hBSP正反义核酸真核表达载体，并用脂质体介导转染人MG-63细胞，通过RT-PCR及Western blot检测细胞中hBSPmRNA和蛋白的表达。结果 成功构建了hBSP正反义核酸真核表达载体，转染后有效表达hBSP，正义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平升高，反义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平降低。结论 转染正反义hBSP表达载体导致瘤细胞BSP表达的改变，为进一步实验研究提供了基础。     

Survivin反义核酸对SKOV3细胞生长及Survivin基因表达的影响

目的 :观察Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长及Survivin基因表达的影响。方法 :应用基因重组技术 ,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的pcDNA3 SVVas经脂质体LipofectamineTM2 0 0 0 介导转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经G4 1 8筛选得到抗性克隆 (SKOV3/SVVas) ,同时以空载体pcDNA3转染SKOV3作为对照(SKOV3/neo) ;绘制细胞生长曲线 ;采用免疫组化、RT PCR和流式细胞仪检测SKOV3、SKOV3/neo及SKOV3/SVVas细胞的内源性SurvivinmRNA及蛋白的表达和凋亡细胞。结果 :与SKOV3及SKOV3/neo细胞比较 ,SKOV3/SVVas细胞增殖和代谢能力均明显降低 ,Survivin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量明显降低 (P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡率显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 :稳定表达的反义Survivin能够有效抑制SKOV3细胞内源性Survivin蛋白的表达 ,诱导SKOV3细胞凋亡。