非病毒载体在siRNA体内递送中的应用

RNAi是一种由siRNA触发的特异基因沉默机制。自其发现以来,RNAi技术迅速发展为药物靶标确认和功能基因组学研究的新策略,并有望成为一种疾病基因治疗学方法。然而,由于siRNA体内不稳定的理化性质,递送siRNA成为RNAi发展的最大障碍。因此研发能够保护siRNA、促进细胞吸收、正确细胞定位和包内体逃逸,结合具有高生物相容性与减少非特异沉默和毒性反应的体内递送系统是RNAi成功用于临床治疗的关键。本文就体内非病毒载体方式递送siRNA的研究进展进行综述。     

RNA 干扰研究的新进展

RNA干扰技术(RNA interference, RNAi) 诞生5年来,无论在技术本身的改进上还是应用上都有了很大的发展,尤其是siRNA的产生和引入方法有了一系列的改进,使siRNA的长期稳定表达成为可能.RNAi的生殖细胞传递现象的发现,进一步拓宽了RNAi的应用潜力.然而,除了对靶基因的沉默效应外,引入的siRNA还可以导致siRNA序列特异性、而非靶基因特异性的基因沉默现象(off-target效应).这就提示,在注释特定siRNA产生的沉默效应时要特别注意,尤其是将siRNA用于疾病治疗时.     

siRNA活性与mRNA二级结构关系的研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使靶基因发生特异性沉默,确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病。在RNAi技术的应用中,通常采用的是19bp长度,正、反义链3′端各有2个不配对核苷酸的双链RNA(siRNA)。而合成siRNA模板的选择,即靶mRNA作用位点的选择对RNAi的作用效果的影响相当大,原因之一是因单链的mRNA存在二级结构。本研究试图从具体的实验结果出发,研究靶mRNA二级结构对siRNA活性的影响。     

siRNA在自身免疫病治疗中的研究进展

小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰(RNAi)的主要介导者,其通过双链RNA(dsRNA)使同源基因沉默,是以核酸为基础最广泛使用于治疗疾病的基因沉默技术。现今,siRNA已被应用于诸多研究领域,在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等自身免疫病中的研究也日益增多。本文对siRNA的发现、siRNA介导的基因沉默机制以及siRNA在自身免疫性疾病治疗中的应用进行综述。     

RNA干扰在哺乳动物细胞高通量基因功能研究中的应用

RNA干扰(RNAi)技术是近年来迅速发展起来的一种高效、特异、易操作的基因阻断技术,它已被应用于线虫、果蝇等低等生物的大规模功能丧失表型遗传学筛选中,并成功鉴定了大量的新基因。近期,在利用现有siRNA文库进行的小规模哺乳动物细胞功能基因筛选研究中,RNAi同样显示了卓越的性能。随着高复杂度的siRNA文库的构建和筛选策略的完善,RNAi在哺乳动物细胞高通量基因功能研究中的应用已日见成熟。     

RNA干扰技术应用的新进展

RNA干扰(RNAinterferenceRNAi)技术是一种发展快并有应用前景的基因控制技术,它能特异地沉默内源或外源性靶基因,目前已应用于多学科的研究。RNAi技术在多种生物体的研究中都可应用,包括植物、真菌、病毒、哺乳类动物等。这项新技术在医学领域的应用尤为突出,不仅可应用于基础研究,还有望成为攻克肿瘤、艾滋病、遗传性疾病等的新的克星,尤其siRNA在治疗疾病方面将有更广阔的前景。RNAi是近10年来分子生物学领域最热门的研究方向之一。     

RNA干扰在免疫学研究中的作用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是内源或外源性双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)诱发的mRNA水平上的基因沉默机制,具有高度特异、高效、持久的特点。RNAi现象在生物界广泛存在,是一种古老而高度保守的防御机制。21bp小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)在哺乳动物细胞中可诱导特异性RNA干扰作用,为人类疾病的研究和治疗提供了新的途径。目前RNAi已经在功能基因组学、免疫学研究、以及基因治疗和信号转导等广泛的领域里取得了令人瞩目的进展。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κBp65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染入小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达,Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用。结果显示:在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κBp65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κBp65的表达也明显受到抑制。说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法。     

RNA干扰技术应用的新进展

RNA干扰(RNA intemrence，RNAi)技术是一种发展快并有应用前景的基因控制技术，它能特异地沉默内源或外源性靶基因，目前已应用于多学科的研究。RNAi技术在多种生物体的研究中都可应用，包括植物、真菌、病毒、哺乳类动物等。这项新技术在医学领域的应用尤为突出，不仅可应用于基础研究，还有望成为攻克肿瘤、艾滋病、遗传性疾病等的新的克星，尤其siRNA在治疗疾病方面将有更广阔的前景。RNAi是近10年来分子生物学领域最热门的研究方向之一。     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。     

Supramolecular assemblies in functional siRNA delivery: where do we stand?

The discovery of RNA interference (RNAi) has excited the scientific field due to its potential for wide range of therapeutic applications. The pharmacological mediator of RNAi, short interfering RNA (siRNA), however, has faced significant obstacles in reaching its target site and effectively exerting its silencing activity. Effective pharmacological use of siRNA requires ‘carriers’ that can deliver the siRNA to its intended site of action. The carriers assemble the siRNA into supramolecular complexes that display functional properties during the delivery process. This review will summarize non-viral approaches to siRNA delivery, emphasizing the current obstacles to delivery and the mechanisms employed to overcome these obstacles. The carriers successfully pursued in pre-clinical (animal) models will be presented so as to provide a glimpse of possible candidates for clinical testing. Supramolecular assembly of nucleic acids with carriers will be probed from thermodynamics and computational perspectives to understand supramolecular structures and their dynamics. The delivery and trafficking requirements for siRNA are then dissected and engineering approaches to overcoming these barriers will be articulated. The latter has been attempted both at the cellular levels, focusing on intracellular barriers, as well as systemic level, emphasizing macroscopic challenges affecting siRNA delivery. Clinical experience with non-viral siRNA delivery is summarized, highlighting the nature delivery modes attempted in clinical settings. We conclude with a perspective on the future of siRNA therapeutics, specifically concentrating on the possible impact of non-viral carriers in the field.     

小干扰RNA与壳聚糖复合纳米粒制备及基因沉默性能研究

小干扰RNA引发的RNA干扰过程在沉默靶基因表达方面表现出高特异性和高效性,有望成为癌症和流感、肝炎等病毒感染疾病治疗的有效药物,但缺少安全高效的载体系统是其发挥强大功能的主要障碍。本研究以天然阳离子壳聚糖为载体材料,利用聚电解质静电作用,直接复合沉默绿色荧光蛋白的siRNA(siRNA-eGFP),制备出siRNA复合率83%~94%、尺寸90~180 nm、Zeta电位10~30 mV的稳定纳米粒,细胞活性保持率达80%,绿色荧光蛋白基因沉默效率近80%。     

转录后水平的基因沉默--RNA干涉

RNA干涉（RNAinterference,RNAi)是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默（PTGS）机制，它利用双链RNA（dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA，从而特异性地阻断相应基因的表达，广泛存在于从真菌到植物。从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中，本文介绍了基因沉默的机理，RNA干涉的分子机制及技术应用等方面的进展。RNA干涉在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中将具有广阔的发展前景。     

siRNA及其导入体内外方法的研究进展

RNAi是一种有效的基因封闭工具，siRNA诱导RNAi效应的发挥。siRNA将哺乳动物细胞内特异基因的mRNA 特异性降解而使基因失活，引起转录后基因沉默。siRNA有效作用的发挥关键是依赖它本身的性能及能否较高效率地转染入靶细胞后与靶基因结合。在体外常通过脂质体、聚乙烯亚胺及电穿孔等介导siRNA的转染。siRNA导入体内的过程则要复杂的多，到目前为止仍缺少有效的方法，常用脂质体和聚合物等来介导转染，依赖靶组织和靶细胞的类型来选用转导途径。     

脂质体介导RNAi的研究

本文选用阳离子脂质体Lipofectamine 2000为基因载体,使用沉默荧光素酶基因的小干扰RNA(siRNA)进行体外RNA干扰(RNAi),对阳离子脂质体转运siRNA的效率进行研究。首先以阳离子脂质体运载质粒DNA转染细胞,并以延滞实验对阳离子脂质体与siRNA的结合能力进行检测;然后通过基因载体将荧光素酶基因载入细胞,转运不同浓度的siRNA对其进行沉默,应用酶标仪对荧光素酶基因的表达进行分析,并用MTT法对转染后细胞存活率进行检测。结果表明:阳离子脂质体Lipofectamine 2000可以高效转运质粒DNA,并可与siRNA很好地结合。在较低的siRNA浓度下,对荧光素酶基因的沉默率达到较高的水平,转运siRNA转染细胞对细胞活性的影响很小,但细胞存活率随着siRNA浓度的增加而逐渐降低。通过优化实验条件,阳离子脂质体转运较低浓度的siRNA即可高效沉默目的基因。     

siRNA构建及转运方法研究进展

RNA干扰是一种由双链RNA引发的转录后基因沉默过程,目前已尝试将其应用于疾病治疗.但是在RNA干扰的应用研究中,最大的障碍是如何将小干扰RNA(siRNA)有效、安全地转运到靶组织和细胞.对近年来有关siRNA转运方式的研究进行综述,为寻求更好地转运方法提供可靠的依据.     

Non-covalently functionalized single-walled carbon nanotube for topical siRNA delivery into melanoma

RNAi can specifically regulate gene expression, but efficient delivery of siRNA in vivo is difficult while it has been shown that modified carbon nanotubes (CNT) protect siRNA, facilitate entry into cells and enhance transdermal drugs delivery. Single-walled carbon nanotubes (SWCNT) were functionalized non-covalently with succinated polyethyleimine (PEI-SA). In this study, the water soluble CNT, PEI-SA/CNT (IS/C) were isolated and characterized, the gene silencing induced by IS/C/siRNA complexes was achieved in vitro in B16-F10 cells. In vivo delivery was topically applied to shaved mouse skin, as well as topically to a C57BL/6 mice melanoma model. We found significant uptake of Cy3-labeled siRNA specific to Braf (siBraf) and gene silencing in the tumor tissue. Treatment with IS/C/siBraf resulted in attenuation of tumor growth over a 25-day period. This new delivery method has provided a new possibility for future siRNA delivery and therapy, which providing insight for the potential application and development of CNT-based siRNA delivery.     

RNA interference-mediated inhibition of brain-derived neurotrophic factor expression increases cocaine's cytotoxicity in cultured cells

Previous studies showed that cocaine exposure decreased brain-derived neurotrophic factor (BDNF) function and resulted in neuronal cell death. To investigate a role of BDNF in cocaine's cytotoxicity, an RNA interference (RNAi) approach was used. Transfection of neuroblastoma SK-N-AS cells or primary rat hippocampal neurons with the small double-stranded interfering RNA (siRNA) targeting BDNF mRNA, but not the scrambled siRNA, resulted in reductions in levels of BDNF mRNA and proteins by more than 70% in the transfected cells as compared with the control group, suggesting an RNAi-mediated, sequence-specific gene silencing. The results also showed that cocaine-induced cytotoxicity, assessed by the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazodium bromide) assay, was more pronounced in the cells transfected with the siRNA than in the cells transfected with the scrambled siRNA or in the cells treated with Lipofectamine 2000 alone (the control group), suggesting that inhibition of BDNF expression enhances cocaine's cytotoxicity. Together with previous studies showing that cocaine suppresses BDNF expression, the present data suggest that the drug-induced reduction of BDNF productions may make neurons more vulnerable to cocaine's toxic effects and precipitate cocaine-induced central nervous system damages.