高尔基体糖蛋白GP73基因的构建、表达及鉴定

目的 重组及表达人高尔基体糖蛋白73( GP73)的融合蛋白,为建立一种新的肝癌诊断方法奠定基础.方法 提取转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞(293细胞)中的总RNA,应用RT-PCR、PCR等技术扩增出GP73基因,将其分别与带有HIS标签的PET-32a及GST标签的PGEX-4T-1载体连接,转化入DH5α菌中...     

高尔基蛋白73单克隆抗体在肝细胞肝癌诊断中的价值

目的 自制高尔基蛋白73(GP73)单克隆抗体并检测其诊断肝细胞肝癌(HCC)的敏感性和特异性.方法 自行制备GP73单克隆抗体,作为一抗用Western blot方法检测59例HCC患者和31名健康对照者血清中GP73蛋白的表达情况,并对结果进行半定量分析,确定对照组人群的正常基线水平.将此结果同多克隆抗体的检测结果及甲胎蛋白(AFP)的诊断结果进行比较.结果 使用单克隆抗体检测健康人群的血清GP73水平为1.2(0.9-1.7)相对单位(RU),HCC患者血清GP73水平为5.7(2.5-7.8) RU,显著高于对照组水平(P<0.001);多克隆抗体检测结果显示,HCC患者血清GP73水平与对照组相比[7.8 (3.0-12.4) RU比1.1 (1.0-2.0) RU]亦显著增高(P<0.001).GP73单抗诊断HCC的敏感性和特异性分别为84.7%和93.5%,对比多抗的敏感性(78.0%)和特异性(93.5%),前者敏感性有所增高;同组患者采用AFP诊断HCC的敏感性和特异性分别为67.8%和74.2%,均低于GP73单抗.Logistic回归分析显示,GP73 单抗的优势比(OR)为7.18,而GP73多抗的OR为1.51.结论 单克隆抗体可以有效地检测肝癌患者血清GP73水平,比AFP具有更高的敏感性和特异性;可能优于目前使用的GP73多克隆抗体的检测.这一结果为用自制单抗进一步开发酶联免疫方法检测奠定了基础.     

高尔基体蛋白73单克隆抗体的制备和鉴定

目的探讨高尔基体蛋白73(GP73)鼠源单克隆抗体的制备方法并进行鉴定。方法用GP73重组抗原蛋白免疫5只小鼠获得血清抗体,免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选后选择GP73抗体阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养,通过腹水制备获得高特异性和高效价的GP73单克隆抗体(单抗)。结果成功筛选出11株能稳定分泌特异性GP73单抗的杂交瘤细胞株,经多次复苏传代仍能稳定分泌特异性强、效价高的抗体。11株单抗均能结合天然状态下的GP73蛋白,与无关蛋白均无交叉反应,提示有较强的特异性。应用筛选出的配对GP73单抗可检测出浓度为1ng/ml的GP73基因工程表达抗原。结论制备的GP73杂交瘤细胞株分泌的抗体对GP73蛋白具有特异亲和性,并且有较高效价,为GP73蛋白诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

血清标本高尔基体蛋白73定量检测及其临床意义

目的 探讨定量测定血清高尔基体蛋白73(GP73)的临床意义.方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定肝癌治疗前、肝癌介入术后、肝癌切除术后、肝移植术后、肝癌复发、乙肝肝硬化、慢性乙型肝炎、乙肝携带者、慢性丙型肝炎、脂肪肝以及健康体检血清标本中的GP73浓度.结果 肝癌治疗前病例组中GP73的ROC曲线下面积为0.983,敏感性和特异性分别为96.8％和93.9％;对比肝癌治疗前,介入术后GP73浓度下降(P＜ 0.001),肝癌切除和肝移植术后GP73浓度下降(P＜ 0.001),肝癌复发伴随GP73浓度升高.与健康体检组比较,GP73浓度在肝硬化病例组中显著升高(P＜ 0.001),但是低于肝癌治疗前病例组中GP73浓度(P＜ 0.001).在慢性乙型肝炎、乙肝携带者、脂肪肝病例组中均可检测到GP73,但显著低于肝癌治疗前病例组(P＜ 0.001).GP73浓度与肝癌分期的相关性不明显.6种非肝脏恶性肿瘤标本中GP73浓度显著低于未治疗的肝癌标本(P＜ 0.001).GP73在丙肝相关肝病的浓度均显著高于乙肝相关肝病(P＜ 0.001).结论 GP73可作为辅助临床早期诊断肝癌的一种标志物,对肝癌术后的复发及肝硬化的进展也有监测作用.     

高尔基体蛋白73和甲胎蛋白在监测肝癌肝切除术后疗效及复发中的作用

目的:探讨高尔基体蛋白73(GP73)和甲胎蛋白(AFP)在监测肝细胞肝癌(HCC)肝切除术后疗效及复发中的作用。方法:收集确诊为肝细胞肝癌并行肝切除术的患者93例,术后随访,监测患者血清GP73和AFP水平。结果:GP73和AFP血清水平与肿瘤大小、数目、有无包膜形成及包膜浸润、有无血管浸润、肝内转移以及肿瘤分化程度相关。随着GP73和AFP浓度升高,GP73和AFP诊断HCC的敏感性降低,而特异性升高。术前和术后GP73和AFP均阳性的患者6个月内肿瘤的复发率明显升高。结论:GP73和AFP是良好的监测HCC术后疗效及肿瘤复发的血清标记物。     

人Ⅱ型高尔基体膜蛋白73多克隆抗体的制备及免疫学鉴定

目的制备人Ⅱ型高尔基体膜蛋白73(Golgi protein 73,GP73)的多克隆抗体,为进一步研究GP73的功能奠定基础。方法利用重组原核表达载体PET-32a-GP73在大肠杆菌BL21中诱导表达,利用切胶方法回收纯化蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体。制备的抗体经硫酸铵沉淀纯化后,用ELISA法和Western blot对多克隆抗体进行效价和特异性检测,用免疫组织化学法(IHC)检测纯化抗体在不同肝组织中识别GP73的能力。结果 GP73蛋白表达成功,并成功获得纯化的GP73蛋白及兔抗GP73多克隆抗体;ELISA法测定多克隆抗体效价>16 000;Western blot证明多克隆抗体的特异性良好;IHC显示GP73蛋白在正常肝组织中仅表达于胆管上皮细胞,而在肝癌组织中表达于肝癌细胞和胆管上皮细胞。结论成功获得了纯化的GP73蛋白及高效价的多克隆抗体,肝脏组织的IHC验证了其良好的特异性。     

高尔基体蛋白73在上皮性卵巢肿瘤中的表达及意义

目的 研究正常卵巢组织及良性、交界性、恶性卵巢肿瘤组织中高尔基体蛋白73(GP73)的表达的差异,初步探讨GP73的表达与卵巢癌发病的关系及与卵巢癌预后的相关性.方法 免疫组织化学法检测卵巢癌组织68例、交界性卵巢上皮肿瘤21例、良性卵巢上皮肿瘤26例、正常卵巢组织20例中GP73的表达,结合临床病理特征分析其与卵巢癌预后的相关性.结果 GP73在正常卵巢组织及良性、交界性、恶性卵巢上皮肿瘤组织中均有表达;与正常组比较,GP73在良性、交界性组中的表达无明显差异(P＞0.05),而在恶性组中高表达(P＜0.01);在恶性组中,GP73的表达与临床分期、分级相关,而与组织类型无关;GP73的表达与术后生存时间相关,术后生存时间越短,GP73表达越高.结论 GP73在恶性卵巢上皮肿瘤组织中高表达,且随着组织分化程度越差,临床分期越晚,其表达也随之增加,恶性卵巢上皮性肿瘤患者的术后生存时间越短,GP73的表达越高.为判断肿瘤的恶性程度及预测患者术后生存时间提供理论依据.     

高尔基体蛋白GP73在肝癌诊断中的意义

目的 通过定量技术检测患者血清中高尔基体蛋白73（GP73）的含量,并对比甲胎蛋白AFP含量,探讨GP73在肝癌患者血清中的临床诊断意义。方法 收集肝癌患者、肝炎肝硬化以及正常健康人员血清样本,分别采用双抗体夹心酶联免疫定量和电化学发光法来检测GP73和甲胎蛋白AFP。结果 （1）在120例肝癌标本中,GP73的阳性率为70.00%,AFP的阳性率35.83%, 两者差异有显著性（χ2=28.18,p<0.01）;（2）在非肝癌患者人员中,GP73的诊断特异性为93.14%（190/204）,AFP的诊断特异性为85.27%（176/204）;（3）ROC曲线分析显示,GP73和AFP的曲线下面积分别为0.8775和0.682。结论 GP73用于诊断肝癌效果明显,可以显著提高肝癌诊断的灵敏度和特异性,而且GP73受炎症影响较小。     

高尔基体糖蛋白73在原发性肝癌中的表达及意义

目的：探讨血清高尔基体糖蛋白73（GP73）在原发性肝癌患者中的临床应用价值。方法：收集肝癌实验组患者53例、肝病对照组患者88例、肝癌复发监测组患者8例、肝癌疗效观察组13例和健康对照组20例血清,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测法测定血清GP73的浓度,7600生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（ALT）、直接胆红素（DBIL）、总胆汗酸（TBA）的水平。结果：肝癌实验组血清GP73水平高于肝病对照组及健康对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;血清GP73水平分别与ALT、DBIL、TBA水平高度相关,差异具有统计学意义（P〈0.05）;血清GP73水平与门脉癌栓的发生相关,差异具有统计学意义（P〈0.05）;肝癌疗效观察组有3例血清GP73浓度随着有效治疗下降;肝癌复发监测组8例GP73随着肿瘤复发而上升,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：血清GP73可作为反映原发性肝癌患者肝损伤的血清指标,对原发性肝癌的辅助诊断、疗效观察、预后判断、复发监测具有临床意义。     

MMP-9和GP73在原发性肝癌中的表达及意义

目的：观察基质金属蛋白酶-9（ MMP-9）和高尔基体糖蛋白73（ GP73）在原发性肝癌（ primaryhepatocarcinoma , PHC）组织中的表达,并探讨其与原发性肝癌临床病理特征的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测55例原发性肝癌和15例正常肝组织中MMP-9和GP73的表达情况。结果：MMP-9和GP73在PHC组中的阳性表达率分别为74．5％、81．8％,均明显高于正常肝组织组（26．7％、33．3％）,2组之间的差异显著（P＜0．01）。 GP73的阳性表达与患者的性别、年龄、肿瘤的数目及包膜有无无关（P＞0．05）,而与肿瘤的大小、Edmondson分级及有无转移有关（P＜0．05）;MMP-9在肝癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的数目无关（P＞0．05）,与肿瘤的大小、包膜有无、Edmondson分级及有无转移有关（P＜0．05）。结论：MMP-9和GP73在肝癌组织中的表达升高,二者联合检测可作为PHC诊断和预后的指标。     

抗人黑色素瘤单抗HB8759轻,重链可变区基因的克隆和序列分析

获得新的鼠抗人黑色素瘤单Ｒ抗ＨＢ８７５９轻，重链可变区基因，以便对其进行基因工程改造。方法：采用反转录－ＰＣＲ从杂交瘤细胞中扩增抗体轻，重链可变区基因，测定ＤＮＡ序列，输入计算机分析，并在大肠杆菌中表达。结论：ＶＨ，ＶＬ基因均为新发现的基因序列，符合功能重排的鼠抗体可变区基因特征。     

胃泌素释放肽前体及其单克隆抗体对肺癌细胞株增殖的影响

目的 探讨胃泌素释放肽前体(Pro-GRP)和Pro-GRP单克隆抗体(McAb)对人肺癌细胞株(A549)增殖的影响. 方法 将浓度为1×10-6-1×10-3mol/L的Pro-GRP和效价为1:80-1:10的Pro-GRP McAb及浓度为1×10-5 mol/L的Pro-GRP与效价为1:80-1:10的Pro-GRP McAb作用于人肺癌细胞株,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖水平. 结果 Pro-GRP在1×10-6-1×10-3 mol/L浓度范围内A549细胞密度逐渐增加;用效价为1:80-1:10的Pro-GRP McAb处理A549细胞密度逐渐减少,而且使预先用1×10-5mol/LPro-GRP处理过的A549细胞逐渐减少. 结论 Pro-GRP能促进人肺癌细胞株的增殖;Pro-GRP McAb可抑制人肺癌细胞株的增殖,且能阻断Pro-GRP对细胞的促增殖作用.     

人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。     

抗肿瘤转移肝素酶特异性抗体的筛选及鉴定

目的通过鉴定制备的人肝素酶单克隆抗体,筛选出具有抗肿瘤转移特异性的单克隆抗体株,并大量制备.方法采用Western blot技术,以HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS、MCF-7细胞总蛋白为样本,对已制备的3株人肝素酶单克隆抗体进行初步鉴定,筛选出能够与肝素酶蛋白特异性结合的抗体,并采用免疫细胞化学技术进一步验证筛选出的抗体特异性,然后通过Transwell体外侵袭实验观察筛选出的肝素酶单克隆抗体对肿瘤转移的抑制作用.结果已制备的3株人肝素酶单克隆抗体均能与不同肿瘤细胞肝素酶蛋白结合,其中12号抗体与商品化肝素酶单克隆抗体在MCF-7细胞中均检测出肝素酶弱阳性表达,其特异性最佳;免疫细胞化学结果也显示在SGC-7901、HepG2、MKN45、SW480和U2OS细胞中12号抗体能检测出肝素酶阳性表达,而在MCF-7细胞中检测出肝素酶弱阳性表达;Transwell体外侵袭实验结果显示12号抗体(100 μg,浓度约1 mg/ml)作用于SGC-7901、HepG2、MKN45、SW480和U2OS细胞48 h后,其穿膜细胞数与正常小鼠IgG对照组相比明显减少(P<0.05).结论纯化制备的人肝素酶单克隆抗体能够与肿瘤细胞表达的肝素酶蛋白特异性结合,并通过抑制肝素酶蛋白达到抑制肿瘤细胞的扩散与转移.     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的筛选

目的　构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。　方法　以ＲＴ－ＰＣＲ法从经Ｂｅｌ７４０４细胞免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Ｆｄ 段及к链基因,克隆到表达载体ｐＣＯＭＢ３Ｈ－ＳＳ中并将抗体Ｆａｂ 段表达于单链噬菌体表面,构建噬菌体抗体库;以Ｂｅｌ７４０４细胞为抗原对噬菌体抗体库进行４轮“吸附－洗脱－扩增”的亲和筛选,挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。　结果　建成容量为２×１０６ＣＦＵ 的噬菌体抗体库,在亲和筛选过程中,噬菌体收获率逐轮得到提高,第４轮为第一轮的２４５ 倍,含Ｆａｂ 基因的克隆比率也由２６％ 增到８３％ ,挑取的１０ 个克隆中有８ 个与Ｂｅｌ７４０４细胞有结合活性。　结论　噬菌体抗体库技术系高效筛选体系,为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径     

具有中和功能的抗单体C-反应蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的:制备单体C-反应蛋白(monomeric C-reactive protein,mCRP)的单克隆抗体。方法:用合成的人C-反应蛋白末端八肽氨基酸,与牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用Protein G亲和层析法纯化抗体,用间接ELISA和Western blot方法测定抗体特异性,并采用该单抗研究其对mCRP干预的乳大鼠心肌细胞的保护作用。结果:得到1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,抗体活性良好,并且该抗体可以降低mCRP导致的心肌细胞TGF-β的表达。结论:成功获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其初步应用进行了鉴定,并证实其可以中和mCRP引起的心肌细胞的损伤作用。