人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区(Ck)/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法:设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段,人工合成tP序列,连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a后,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化.细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性.结果:成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达.表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力.结论:ScFv与Ck,tP融合后,同时具有抗原和DNA结合活性,为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.     

人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HBsAg单链抗体(ScFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine, tP)融合基因,在大肠杆菌中进行表达纯化并分析ScFv/tP融合蛋白的活性. 方法:设计引物扩增人抗HBsAg ScFv HBs15基因,在其3'端引物引入tP的编码基因,PCR扩增获得ScFv/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-32a后,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导表达. 表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化. 间接ELISA分析ScFv/tP融合蛋白的亲和活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合的情况. 结果:成功获得人抗HBsAg ScFv/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达,表达的ScFv/tP融合蛋白不仅保持了与HBsAg结合的能力,同时具有DNA结合活性. 结论:ScFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,为该ScFv的进一步应用奠定了基础.     

抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评价

目的 构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能.方法 通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRa pMD 19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体构建;构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,经两步亲和纯化后获得scFv-tP蛋白;采用凝胶阻滞电泳迁移率变动分析EMSA技术检测Anti-MM scFv-tP与siRNA的结合活性;荧光分子标记scFv-tP蛋白后分别采用流式细胞术检测和共聚焦显微镜观察其与LiBr细胞株进行细胞表面抗原结合活性验证;采用不同浓度FITC标记的siRNA与scFv-tP进行混合,分别与LiBr细胞(A)及DU145细胞(B)进行混合孵育,观察肿瘤细胞对携载siRNA的单链抗体的内化活性.结果 成功构建抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表达载体;实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,可获得较纯的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白与siRNA有明显的结合与携载能力,可以有效与LiBr细胞表面特异性抗原进行结合,且有较强的内化活性.结论 本研究构建的抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体可稳定表达,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA结合携载能力,可靶向识别结合进入LiBr细胞,为后续进一步研究该单链抗体融合蛋白靶向载体携载siRNA在体内外抑制恶性黑色素瘤恶性进展奠定坚实的基础.     

HV单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P的构建和表达

目的:构建汉坦病毒(Hantavirus, HV)单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P基因的原核表达载体,蛋白经表达后纯化并进行1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的功能活性鉴定.方法:采用PCR的方法,扩增单链抗体基因1A8 ScFv和1A8 ScFv/Cκ,将鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物,获得HV单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因1A8 ScFv/Cκ/P. 将获得的重组基因克隆入原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21中表达. 表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,用Ni-NTA螯合层析介质进行纯化. 采用ELISA方法分析1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与HV抗原的结合活性,凝胶迁移阻滞实验检测1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与质粒DNA的结合活性. 结果:成功构建了HV 1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白基因的表达载体,在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 通过功能活性测定,纯化的1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白既保持了与HV抗原的结合能力,同时又具有与核酸的结合活性. 结论:构建和表达的HV 1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白具有HV抗原结合活性和DNA结合的活性.     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...     

全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析

目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性?方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体?以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000?纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础?     

全人源抗MAGE-A1单链抗体的筛选及免疫活性鉴定

目的:从全人源单链噬菌体抗体库中筛选出抗MAGE鄄A1特异性单链抗体并进行免疫活性鉴定。方法:以纯化MAGE鄄A1为抗原,经过五轮吸附—洗脱—扩增,从单链噬菌体抗体库中筛选出特异性抗MAGE鄄A1噬菌体抗体,ELISA、DotBlotting检测其抗原结合能力,并对特异性较强的克隆提取质粒,表达可溶性抗体。WesternBlotting、DotBlotting、免疫细胞化学检测其抗原结合活性,非竞争ELISA法检测其亲和常数。结果:从单链噬菌体抗体库中筛选出噬菌体抗体并进行富集,经鉴定为抗MAGE鄄A1的特异性噬菌体抗体。抗MAGE鄄A1可溶性抗体分子量约为30kD,与MAGE鄄A1特异性结合,其亲和常数约为1.432×106L/mol。结论:所得全人源抗MAGE鄄A1单链抗体保留完整抗体分子结合抗原的特异性,免疫原性弱,是肿瘤导向治疗的理想载体。     

流式细胞仪鉴定抗人CD3单链抗体活性

０　引言　ＣＤ３分子是Ｔ细胞表面的一种分化抗原,与Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）形成ＴＣＲ／ＣＤ３复合物,参与Ｔ细胞活化的信号转导途径．１９７９年Ｋｕｎｇ等［１］最早制备了抗ＣＤ３单克隆抗体ＯＫＴ３．ＯＫＴ３最初主要应用于抑制异体移植的免疫排斥反应,后来又发现其具有丝裂原作用,在其他细胞和细胞因子的辅助下,可刺激Ｔ细胞的增殖和活化［２］．为克服鼠源性抗体应用于人体产生人抗鼠抗体（ＨＡＭＡ）的不足,我们应用基因工程技术对抗体进行改造,构建了抗人ＣＤ３单链抗体基因［３］,并在大肠杆菌高效表达．本实验研究采用…     

SA/hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

目的 制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15 (hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率.结果 成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%).SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白.结论 SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础.     

表皮生长因子受体及p53抑癌基因蛋白在老年妇女外阴营养不良及外阴癌中的表达及意义

目的探讨老年妇女外阴外阴营养不良组织中表皮生长因子受体(EGFR)及p53表达及临床意义.方法应用免疫组化法对老年妇女外阴正常外阴皮肤、慢性外阴营养不良、不典型增生和外阴癌组织进行标记.结果EGFR在正常外阴皮肤基底层有弱阳性表达,p53均阴性.EGFR在增生型、硬化苔癣型和混合型营养不良三者之间阳性率比较,差异均无显著性意义(P＞0.05);不典型增生和鳞癌的阳性率均明显高于各型营养不良(P＜0.05);而鳞癌与不典型增生之间差异无显著性意义(P＞0.05).p53基因蛋白在外阴不典型增生和外阴癌的表达率显著高于外阴营养不良病变的各型营养不良组织(P＜0.01).结论老年妇女外阴癌组织中p53与EGFR阳性表达率较高,EGFR与p53突变在老年妇女外阴癌的发生过程中起重要作用.     

靶向EGFR/HER-2的双特异性融合蛋白Ec-LDP-Hr及其烯二炔强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的抗结肠癌活性

目的 研究靶向EGFR/HER-2的融合蛋白Ec-LDP-Hr及其烯二炔强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对结肠癌的抗肿瘤活性.方法 ELISA和细胞免疫荧光法鉴定融合蛋白与结肠癌HCT-15的结合活性.克隆形成实验和MTT法检测Ec-LDP-Hr对结肠癌HCT-15细胞的增殖活性影响,并用Western blot法检测EGFR/HER-2的表达量改变.用MTT法和流式细胞术检测强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对HCT-15的细胞毒性及诱导凋亡情况.体内实验研究融合蛋白Ec-LDP-Hr、强化形式Ec-LDP-Hr-AE及其联合对裸鼠结肠癌移植瘤的抑瘤效果.结果 结肠癌HCT-15、HCT-116和HT-29细胞都显示较高的EGFR和HER-2表达量.融合蛋白Ec-LDP-Hr能与结肠癌HCT-15细胞结合,并可通过下调靶点EGFR/HER-2的表达从而抑制HCT-15细胞的克隆形成和细胞增殖.强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对HCT-15有很强的细胞毒作用,并且在低浓度下即可诱导细胞的凋亡.动物实验结果显示融合蛋白和强化融合蛋白对结肠癌HCT-15裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为和37.6％和56.7％,两者联合可提高抑瘤率至71.4％.结论 靶向EGFR/HER-2的双特异性融合蛋白Ec-LDP-Hr对结肠癌HCT-15的裸鼠移植瘤有一定的抑瘤作用,联合强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE能提高抗结肠癌疗效.     

EGFR特异性单链抗体与靶细胞结合的特异性

目的:检测EGFR特异性单链抗体F4-scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合特性。方法:提取细菌周质腔蛋白经N i-NTA柱纯化F4-scFv;采用流式细胞术及W estern b lot检测F4-scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合的特异性。结果:N i2+柱纯化的F4-scFv经SDS-PAGE可见分子量为36 kDa单一条带,F4-scFv可与EGFR阳性细胞CHO-EGFR-GFP1、A431及MDA-MB-231特异性结合,而不与EGFR阴性细胞CHO-K1及SKOV3结合。结论:F4-scFv可与天然表达EGFR的细胞特异性结合,为其靶向抗肿瘤研究奠定了基础。     

hIL-15-SA双功能融合蛋白的制备

目的：对双功能融合蛋白hIL-15-SA的发酵及纯化工艺进行研究。方法：采用发酵罐高密度发酵hIL-15-SA工程菌,通过镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化目的蛋白。免疫印迹分析产物,淋巴细胞增殖试验以及细胞锚定试验检测双功能融合蛋白hIL-15-SA的生物学活性。结果：采用半合成培养基,以3%的接种量,pH值为7.2发酵可得到湿菌47 g/L,21.15 g/L包涵体。经纯化后目的蛋白纯度为97%。细胞增殖试验和细胞表面锚定修饰试验表明,经纯化复性的hIL-15-SA融合蛋白具有双重生物活性。结论：本研究获得了高产量、高纯度的hIL-15-SA双功能融合蛋白,为后续的体内生物学功能研究奠定了基础。     

Expression and characterization of Mac-1-FP fusion protein in CHO cells

To construct mammalian cell expression vectors for Mac-1 with CFP and YFP and apply FRET to study the dimerization and function of CD1 lb( Mac-1 α subunit) and CD18( Mac-1 β subunit). Methods: The mammalian cell expression vector for CD1 lb fused with CFP at the carboxyl terminal was constructed to create recombinant plasmid of pCD11b-CFP. Then pCD11b-CFP was co-transfeeted with pYFP-CD18 into CHO cell, a fibroblast like cell line, as a target cell within which there are some signal pathways involved in inflammatory stimulation but without endogenous Mac-1. Then CHO cells stably expressing both CD11b-CFP and YFP-CD18 fusion proteins were selected by Western blot and laser scanning confocal microscope. Results: The cyan and yellow fluorescence in co-transfected positive CHO cells were observed under a fluorescence microscope. CHO-Mac-1-FP cells stably expressing both CD11b-CFP and YFP-CD18 fusion proteins were obtained as demonstrated by Western blot successfully. The adhesive activity of CHO-Mac-1-FP cells with CHO-ICAM-1cells was increased markedly bv treatment with PMA, suggesting the translocation of CD11b-CFP and YFP-CD18 to the plasma membrane in CHO-Mac-1-FP cells and dimerization of CD11b-CFP and YFP-CD18 just as the function of the wild type Mac-1. Conclusion: CHO-Mac-1-FP cells with adhesive activity are established successfully, thus CHO-Mac-1-FP cells may be useful for the study of Mac-1 by FRET and for other purposes.     

西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备以及应用分析

目的制备针对西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体,并分析其在临床检测中的应用价值。方法采用原核表达系统表达西尼罗河病毒preM/E融合蛋白,作为抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用有限稀释法筛选能稳定分泌抗preM/EⅢ单抗的杂交瘤细胞株。接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔,抽取腹水纯化单克隆抗体。采用间接ELISA和Western blotting对抗体特异性和效价进行分析,并对临床样本进行检测。结果获得了1株能稳定分泌preM/EⅢ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为ME1。纯化后抗体效价为10-6,其亚类为IgG1。ME1单抗能与西尼罗病毒preM/EⅢ蛋白以及西尼罗病毒发生特异性反应,而与日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)无交叉反应。临床诊断准确率为97.78%。结论 ME1单克隆抗体具有较高的特异性,临床诊断准确性较高,具有临床应用价值。     

去唾液酸糖蛋白受体单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其靶向性观察

目的：表达和纯化去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白．体外观察其肝癌细胞的特异性结合能力。方法：通过扩增构建成含C1与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的原核表达质粒GFPCI／pET-26b：测序验证后转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达，荧光显微镜下观察融合基因中GFP的表达情况：用Ni^2＋螯合柱亲和纯化融合蛋白GFPCI，SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白GFPCI；纯化的融合蛋白GFPCI与HepG2细胞经体外孵育后在荧光显微镜下观察单链抗体Cl对肝癌细胞的靶向作用。结果：IPTG诱导表达后在荧光昆微镜下可以观察到大肠杆菌发出特异性的绿色荧光；SDS-PAGE显示表达的融合蛋白GFPCI，与预期的大小相一致，以包涵体的形式存在；通过变性条件下Ni^2＋亲和柱纯化获得较GFPCI重组融合蛋白，免疫荧光检测表明纯化的GFPCI可与HepG2细胞膜特异结合。结论：利用GFP作为标记分子．观察到去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与HepG2细胞膜较强的结合能力．为应用Cl对肝癌进行靶向生物治疗奠定基础；构建成功的GFP／pET-26b原核表达系统为其他靶分子的研究提供了一个有力的工具。     

s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位

目的:观察s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达及定位。 方法：根据s-lap基因的编码区序列, 应用PCR技术突变其3′末端终止密码子, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合,构建s-lap/GFP重组质粒;采用脂质体转染法, 将s-lap/GFP融合基因转入Hela细胞中, 用荧光显微镜观察其表达。 结果:s-lap/GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的Hela细胞中,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的Hela细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达。 结论：s-lap/GFP融合蛋白可在人Hela细胞中表达,并主要定位于细胞核。