禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5Nl血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性.方法 PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达.采用细胞免疫荧光、Western blotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析.结果 在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64 000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Western blotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合.结论 经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础.     

H5N1人禽流感病毒HA基因的克隆和表达

目的对人禽流感病毒A/China/GD01/06（H5N1）HA基因进行克隆和表达,为进一步研究GD01/06HA的致病与免疫机制提供有效制剂。方法将H5N1全长HA基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并对表达的重组蛋白进行鉴定。结果经检验重组质粒p32-HA构建成功,表达蛋白分子量介于66.2~94.0kd。经鉴定所表达的特异性条带为HA蛋白片段。结论HA基因在大肠杆菌中表达并获得特异性重组蛋白,为其生物学、免疫学功能的研究提供了基础。     

东南亚禽流感病毒H5N1的HA基因特征分析

目的分析东南亚禽流感病毒HA基因和蛋白序列的特点,比较与我国人禽流感病毒的异同,为人禽流感防控工作提供参考。方法从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒HA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树。结果东南亚各国H5N1病毒受体位点氨基酸为QSG;越南、泰国、柬埔寨HA蛋白关键位点氨基酸基本没有变化;印尼多个样本发生改变,进化树中聚于一个分支内;中国人与老挝、马来西亚样本关键位点氨基酸相同,进化树中处于同一分支中。结论越南、柬埔寨和泰国H5N1病毒流行株HA蛋白未影响病毒毒力,印尼为一独立的病毒体系,中国与老挝和马来西亚样本来源于同一毒株,中国、老挝和马来西亚之间存在着病毒扩散现象。     

禽流感H5N1型病毒对沙鼠致病性的初步研究

目的 观察禽流感H5N1型病毒对沙鼠的致病性。方法 在生物安全三级实验室，将禽流感H5N1型病毒通过滴鼻接种乙醚麻醉后沙鼠，观察14d，记录沙鼠的体温、体重、临床体征、病理学变化、病毒分离情况及抗体变化。结果 沙鼠感染后发病主要表现在第2～6天，攻毒组沙鼠出现反应迟钝、皱毛、弓背、食欲下降、呼吸急促、打堆等体征，攻毒组沙鼠的体温降低和体重减轻，死亡率为44％，在攻毒后8d检出抗体，主要病理学变化表现为肺出现严重淤血、水肿、出血，镜下可见肺间质充血，血管周围炎性细胞浸润，肝和胸腺淤血，肾出血，肾小管变形。结论 禽流感H5N1型病毒对沙鼠有较强致病性。     

高致病性H5N1型禽流感

目的:高致病性H5N1型禽流感在亚洲的持续爆发引起了人们对全球流感大流行的担心。截至2006年2月,已有160多人被证实感染了H5N1型禽流感,80多人已死亡。本文对H5N1型禽流感的起源,传播,预防及治疗,以及可能的流行情况进行了综述。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

广州市一起水禽H5N1疫情禽流感病毒血凝素基因分析

目的了解广州市一起水禽H5N1疫情中高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因的特点以及与其他毒株序列间的关系。方法自疫点采集97份咽拭子标本及84份环境拭子标本,实时荧光RT-PCR检测H5核酸,从阳性标本中扩增全长HA基因并作序列测定,同2006年广州市及国内其他地区报道的人禽流感病毒HA基因进行比较并作系统发生分析。结果从一份环境拭子中扩增获得一株H5N1禽流感病毒HA基因,系统发生树分析发现与广州市2006年人禽流感病毒HA序列一致性较高,且与国内其他地区报道的H5N1病毒HA基因属于同一组;从基因序列推导出HA的氨基酸序列,发现其受体特异性为禽源的,蛋白酶水解位点含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。结论引发此次禽间禽流感的为高致病性H5N1病毒,和广州市人禽流感的H5N1病毒在遗传上有紧密的亲缘关系。禽源性的H5N1病毒仍存在感染人类的可能性,禽类从业人员目前处于感染高致病性禽流感的高危状态,进一步加强对活禽市场和禽类从业人员的监测,对于预防禽流感的流行具有重要意义。     

H5N1型高致病性禽流感研究进展及其对人类的威胁

H5N1高致病性禽流感是人、禽和其它哺乳动物共患的一种新发传染病,近年禽间疫情波及范围越来越大,人间疫情呈地方性流行趋势.发病人群年龄偏低、病死率高.禽流感病毒有可能变异成一种即有高致病性又有人流感病毒高传播性特点的新型流感病毒,构成越来越严峻的大流行威胁.本文着重就流行病学、病原学及防制对策方面的相关进展进行综述.     

H5N1亚型禽流感病毒对小鼠致病性的研究

目的用一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠,观察其对小鼠的致病性及在小鼠间的传染性。方法将小鼠分为正常组、攻毒组、同居组,攻毒组乙醚麻醉后滴鼻感染AIV,观察各组食欲、反应、呼吸及有无皱毛、弓背、死亡等,测量体温及体重;检测相应抗体水平、小鼠排毒情况及小鼠各器官带毒情况,并观察病理组织学变化。结果攻毒组出现食欲反应下降,呼吸急促,皱毛,死亡;体重、体温下降。同居组未出现感染。攻毒组攻毒后12 h至第9天可从肺组织分离出病毒,第10天始出现相应抗体;感染小鼠的肺、心肌、肝、脾、肾和脑组织都有不同程度的病理改变。结论 AIV对小鼠具有致病性,AIV能跨越种系障碍直接感染哺乳动物, 但在小鼠间无传染性。     

H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测方法的初步建立

目的研制H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。方法将所获病毒通过鸡胚扩增，离心，纯化，通过测定最佳抗原工作浓度、最佳酶工作浓度、最佳血清工作浓度来确定ELISA检测方法。结果确定最佳抗原包被浓度为1：20000、酶工作浓度为1：10000、阳性血清最佳工作浓度1：1000。结论初步研制成功了H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。     

禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病敏感性研究

目的观察禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病性。方法将NIH小鼠随机分为接毒组(20只)和对照组(10只),在负压感染实验室,接毒组于乙醚麻醉后给予AIVH5N1型病毒滴鼻,对照组予正常阴性尿囊液滴鼻,观察14d,记录小鼠的体温、体重、临床症状、死亡情况、病理变化、肺指数及抗体变化。结果 NIH小鼠感染禽流感H5N1型病毒后第1天就出现精神不振,病程主要集中在第3～7天,临床症状主要表现为弓背、蜷缩、竖毛、颤抖、反应迟钝、活动减少、爱扎堆,体重(下降)出现减轻,体温降低,死亡率为40%;接毒组死亡小鼠肺指数为(2.21±0.40),较对照组的(0.44±0.23)明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);肺组织病理严重改变,第8天才能检出抗体(OD值等于0.231)。结论禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠有一定的致病性。     

深圳市一起人感染高致病性禽流感病例的流行病学调查

目的 明确人感染高致病禽流感病例的感染来源,探索是否存在人与人之间的传播,为进一步认识与防治禽流感提供科学依据.方法采用现场流行病学调查和实验室检测相结合的方法进行调查、诊断.结果 发现2011年深圳首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)确诊病例,无明确病、死禽接触史,密切接触者中无不明原因肺炎病例,未发现人-人传播证据.结论 2011年深圳人感染高致病性禽流感病例属感染个案,未发现人传人现象,感染来源可能与农贸市场环境有关.今后应继续加强不明原因肺炎监测,加强人感染高致病性禽流感的应急贮备、培训和健康教育.     

不同职业暴露人群感染H5N1禽流感病毒风险性分析

目的了解长沙地区不同类型禽类职业暴露人群高致病性禽流感H5N1亚型病毒的抗体分布状况,分析不同职业暴露人群H5N1感染的风险性。方法采集菜市场家禽屠宰零售人员、大型家禽饲养企业工人和农村个体家禽散养人员的血清标本,用单放射免疫扩散溶血技术（SRH）检测H5N1抗体。结果市场零售人员、农村个体家禽散养人员、企业饲养人员H5N1感染率分别为25%、1%和1.92%,男性从业人员H5N1抗体阳性率为10%,女性为23.88%。结论市场零售人员感染H5N1风险性远高于农村散养人员和企业饲养人员,不同职业人员中女性H5N1抗体阳性率高于男性从业人员。     

人禽流感H5N1毒株PB1基因突变分析

目的 通过对人禽流感H5N1毒株PB1基因序列的变异分析,揭示毒株PB1基因的特征与进化.方法 检测广东地区人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株PB1基因序列,采用DNA Star Lasergene软件对检索的人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列进行比对和分析,并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果 将50株毒株PB1基因核苷酸序列按同源性分成两组:1997-1998年毒株为第1组(G1),2003-2006年毒株为第2组(G2).PB1基因74个氨基酸发生位点置换,占9.78%(74/757).PB1基因Ks值为26.1×10-6～39.8×10-6Nt/d,Ka值为3.91×10-6～5.59×10-6 Nt/d,检验结果显示,基因进化受到负选择性压力.2003-2006年毒株(G2)丢失G757,引起氨基酸结构改变;同时糖基化位点也较1997-1998年毒株减少了1个糖基化位点NES382-384.结论 目前PB1基因进化分成两组,自发突变作用影响PB1基因进化;PB1基因与PB2基因的进化途径在时间特征和区域特征方面类似.2003-2006年毒株PB1基因氨基酸结构和糖基化位点均有改变.     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。     

假病毒技术在抗H5N1禽流感病毒中药筛选中的应用及评价

目的：建立基于假病毒技术的抗H5N1禽流感病毒中药筛选方法,利用血清药理学的方法系统评价攻下方、解毒方、凉血方和扶正方4类中药复方体外对H5N1禽流感病毒活性的影响及其机制。方法：构建整合H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白的假病毒,雄性Wistar大鼠25只灌胃不同中药制备复方中药血清。采用犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞和人胚肾细胞293T为研究对象,将不同浓度药物血清分别与假病毒或靶细胞体外培养后,观察药物血清对假病毒活性的直接抑制作用,通过流式细胞术检测药物血清对H5N1禽流感病毒HA蛋白表达的影响。结果：HA蛋白特异性中和抗体2B4在50μL（抗体总量500μg）、25μL（抗体总量250μg）及12.5μL（抗体总量125μg）的剂量条件下均可以有效抑制假病毒的感染活性,从而证实利用假病毒技术筛选药物的方法的可行性。与对照血清相比,4种复方中药含药血清体外对假病毒均无明显抑制作用（P〉0.05）,也不能有效预防假病毒感染（P〉0.05）,不能抑制H5N1流感病毒HA蛋白的表达。结论：假病毒技术是一种安全、高效、精确的筛选抗H5N1禽流感病毒中药的方法;4类复方中药含药血清并不含有作用于H5N1假病毒HA蛋白及唾液酸α-2,3半乳糖苷受体的有效成分或单体。     

2010年广州市甲型H1N1流感病毒分离株HA基因变异分析

目的比较2010年广州市分离到的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因和2009年中国大陆甲型H1N1流感病毒HA基因的变异情况,为甲型H1N1流感的监测和防控提供理论依据。方法收集2010年广州市有发热和呼吸道症状病人的咽拭子标本,用H1N1流感特异性引物进行PCR检测,扩增分离到的H1N1病毒HA片段,测序后与2009年的H1N1毒株进行比对和分析,并用生物信息学方法对抗原位点和糖基化位点进行分析。结果共收集到426份标本,甲型流感阳性211份,其中H1N1流感4株,与2009年分离的甲型H1N1流感相比,有12个氨基酸碱基位点发生了有意义突变,其中6个位点位于抗原位点上;4株毒株HA基因145位氨基酸都发生了变异;其中2株毒株在第180位氨基酸位点的抗原位点发生了变异。进化分析表明4株毒株与2009年中国大陆分离的8株毒株进化关系较远。结论 2010年广州市甲型H1N1毒株与2009年相比发生了较大变异。HA基因145位和180位氨基酸位点变异对H1N1毒株抗原变异有重要意义。本文分离的A/Guangdong/ZS03/2010(H1N1)和A/Guangdong/ZS01/2010(H1N1)毒株可能已经发生了抗原性漂移。