调宁蛋白突变体T184A的构建、表达、纯化和鉴定

调宁蛋白突变体Ｔ１８４Ａ的构建、表达、纯化和鉴定卫生部呼吸系疾病重点实验室同济医科大学病理生理教研室（武汉４３００３０）曹圣唐大椿骆建云柯丹调宁蛋白（ｃａｌｐｏｎｉｎ）为平滑肌特有的重要的调控蛋白，它能与肌动蛋白结合，抑制肌球蛋白ＡＴＰ酶活性和平滑肌...     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景：外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力。 目的：探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性。 方法：采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12 d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化。采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Western blot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况。此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线。 结果与结论：成人外周血单个核细胞诱导培养4 d时开始出现细胞集落,12 d时细胞呈明显梭形。流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的(71.8±7.2)%。分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28 d呈旋涡状生长。间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性。Western blot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14, 21 d开始表达,并逐渐增加。生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期。提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞。它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞。     

调宁蛋白B结构域的克隆、表达和鉴定

调宁蛋白Ｂ结构域的克隆、表达和鉴定卫生部呼吸系疾病重点实验室同济医科大学病生教研室（武汉４３００３０）；１同济医科大学药理教研室曹圣卢中举１唐大椿向继洲１王迪浔平滑肌收缩调节的信号转导途径主要有肌球蛋白轻链激酶（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉｎ...     

血管平滑肌细胞凋亡中c-Fos蛋白的持续性表达

血管平滑肌细胞凋亡中ｃ－Ｆｏｓ蛋白的持续性表达戴云张兵（第一军医大学组胚教研室）血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的调亡可能参与血管的发生、重塑及某些心血管疾病的病理过程。本文以低血清条件诱导体外培养ＶＳＭＣ的调亡，初步探讨了其与ｃ－Ｆｏｓ蛋白表达的关系。酶...     

转录调节因子Ets-1在大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用

目的： 研究转录调节因子Ets-1对大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响及其可能的机制。 方法： 用定量细胞DNA片段的方法观察大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡。用Western印迹法检测磷酸化视网膜母细胞瘤（RB-P）蛋白表达。 结果： Ets-1抑制大鼠血管平滑肌细胞凋亡。反义P21WAF1/CIP1能够阻断Ets-1的抗凋亡作用，并抑制Ets-1诱导的平滑肌细胞增殖。Ets-1能够上调RB-P蛋白表达，反义P21WAF1/CIP1可以阻断Ets-1诱导的RB-P蛋白表达。 结论： 在大鼠血管平滑肌细胞中，Ets-1通过P21WAF1/CIP1旁路发挥抑制凋亡和促进增殖作用。     

平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制

在平滑肌收缩活动中 ,肌球蛋白轻链激酶 (MLCK)对肌球蛋白轻链 (MLC2 0 )的钙依赖性磷酸化是引起平滑肌收缩的主要原因 ,同时还存在着其它非钙依赖性的调节途径。高浓度的MLCK和Ca2 + independentLC2 0kinase均可引起MLC2 0 的非钙依赖性磷酸化 ;Rho kinase、花生四烯酸及蛋白激酶C等都能抑制肌球蛋白轻链磷酸酶的活性 ,减少MLC2 0 的脱磷酸化 ;调宁蛋白、原肌球蛋白和钙介导蛋白等能通过与肌动蛋白或肌球蛋白的结合来调节肌球蛋白Mg2 + ATP酶活性。这些因素都有助于维持低Ca2 + 时平滑肌的张力。     

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

背景：平滑肌肌动蛋白α基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一,公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。 目的：利用多位点Gateway技术构建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。 方法：设计合成含有attB位点的小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子引物,构建pUp-平滑肌肌动蛋白α;通过LR反应将pUp-平滑肌肌动蛋白α和pDown-绿色荧光蛋白(含att位点的绿色荧光蛋白入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin,得到pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白表达载体;经PCR和测序鉴定,将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系,并且用免疫荧光染色检测基因的表达。 结果与结论：成功构建pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;细胞转染实验以及免疫荧光检测证实构建的报告基因载体可以反映平滑肌肌动蛋白α基因的表达情况。     

Myocardin重组蛋白表达及其在人骨髓间充质干细胞重编程为血管平滑肌细胞中的作用

目的:研究心肌素(myocardin)重组蛋白的表达及分离纯化方法,并探讨myocardin重组蛋白对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMSCs)向血管平滑肌细胞转分化的作用。方法:构建myocardin原核表达载体,摸索最佳诱导myocardin重组蛋白表达的方法及优化分离纯化方式。使用纳米转导试剂包裹myocardin形成纳米-蛋白复合体,转染h BMSCs,观察蛋白转导效率;蛋白转导成功后,检测血管平滑肌的特异性标志物平滑肌肌球蛋白重链的表达情况,观察h BMSCs向平滑肌细胞转化情况。结果:与传统方法相比较,高浓度法诱导myocardin重组蛋白的表达量更高,新采用的洗脱方式能获取更多的myocardin重组蛋白;纳米-myocardin复合体可成功转染h BMSCs并诱导其向血管平滑肌样细胞转化。结论:Myocardin重组蛋白能被高效转导到细胞内,并促使h BMSCs重编程为血管平滑肌样细胞。     

调宁蛋白的研究近况

调宁蛋白的研究近况曹圣＊综述唐大椿＊审校微血管舒缩功能的紊乱是微循环发生障碍的主要因素之一，引起这些变化的体液因子有组胺、５－ＨＴ、缓激肽、前列腺素和白三烯等，但目前仍不完全清楚它们引起微血管舒缩异常的分子机理［１］。调宁蛋白（ｃａｌｐｏｎｉｎ）是一...     

反义c-myc真核表达载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法:构建反义和正义c-myc真核表达载体pcDNA3-myc-antisense和pcDNA3-myc-sense,利用lipofectin将正义及反义c-myc真核表达载体导入大鼠气道平滑肌细胞,MTT法观察正义和反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用,流式细胞技术检测细胞周期变化,免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达。结果:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,延长细胞S期,反义c-myc真核表达载体可降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达。结论:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖。     

临产后子宫体部平滑肌高表达HSP27和αB-crystallin

 ［摘要］目的:研究临产前后子宫体部平滑肌热休克蛋白27（HSP27）和α-晶体蛋白B链（αB-crystallin）的表达变化,探讨其在临产后子宫平滑肌收缩中的可能作用。方法:采用比较蛋白质组学技术鉴定出足月未临产和自然临产人子宫体部平滑肌中HSP27和αB-crystallin蛋白存在差异性表达,应用RT-PCR、免疫组化和免疫印迹方法对临产前后子宫体部平滑肌中HSP27蛋白的表达进行验证。结果:临产后子宫体部平滑肌高表达HSP27和αB-crystallin（P<0.05）。足月未临产和临产人子宫体部平滑肌双向凝胶电泳图谱均存在4个分子量相等、等电点不同的HSP27蛋白斑点,ImageMaster 2D Platinum 软件分析仅有1个HSP27蛋白斑点具有显著差异（P<0.05）,余3个HSP27蛋白斑点无显著差异（P>0.05）。RT-PCR、免疫组化和免疫印迹对HSP27蛋白验证结果与蛋白质组学一致。结论: HSP27和αB-crystallin蛋白在临产后人子宫体部平滑肌高表达,提示这2个小分子热休克蛋白可能参与了临产后子宫体部平滑肌细胞的收缩事件。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

压力诱导血管平滑肌细胞整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的变化

目的 研究压力对大鼠颈总动脉血管平滑肌细胞整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的分布与表达的影响，探讨它们在血管平滑肌细胞的机械应力信号转导中的作用。方法 不同压力(160mmHg和80mmHg)灌流大鼠颈总动脉30min，免疫组织化学和免疫电镜观察整合素β3、桩蛋白和纽蛋白在血管平滑肌细胞上的表达和分布变化。结果 高压和常压灌流对大鼠颈总动脉平滑肌细胞的整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的表达无明显影响，但高压使整合素β3、桩蛋白和纽蛋白在平滑肌细胞膜上的分布发生改变，向离管腔面的平滑肌细胞膜聚集。结论 高压诱导了整合素β3、桩蛋白和纽蛋白向离管腔面的平滑肌细胞膜聚集。提示整合素β3、桩蛋白和纽蛋白可能在血管平滑肌细胞的机械应力信号转导中发挥作用。     

氧化型胆固醇下调血管平滑肌细胞金属蛋白酶组织抑制剂基因表达

目的:研究氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响。方法:离体培养兔主动脉血管平滑肌细胞,分别用胆固醇、Triol与25-OH负载细胞,狭缝杂交测定TIMP-1mRNA表达,细胞免疫化学测定MMP-9与TIMP-1蛋白表达。结果:Triol与25-OH(1 mg/L,24 h)抑制TIMP-1 mRNA及蛋白表达,对MMP-9蛋白表达无影响。结论:氧化型胆固醇可以下调血管平滑肌细胞TIMP-1基因表达。     

糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞BK_(Ca)通道的变化

目的:探讨糖尿病胃轻瘫(DGP)的发病机制与胃平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)变化之间的关系。方法:将大鼠分为对照组和糖尿病胃轻瘫模型组。应用木瓜蛋白酶液急性酶分离大鼠胃平滑肌细胞,采用单通道膜片钳技术记录大鼠胃平滑肌细胞BKCa电流,免疫组织化学技术测定BKCa蛋白KCNMA和KCNMB1的表达。结果:大鼠胃平滑肌细胞BKCa电流的开放具有电压依赖性和胞内钙离子浓度依赖性,可被钾离子通道阻滞剂Ib TX阻断;模型组大鼠胃平滑肌细胞BKCa开放概率及开放幅度增加(P0.05),平均开放时间及平均关闭时间减少(P0.01);模型组大鼠胃平滑肌细胞KCNMB1蛋白表达增加(P0.01),KCNMA蛋白表达无明显变化。结论:DGP发病与胃平滑肌细胞BKCaβ1亚基蛋白表达上调及通道功能活动增强有关,β1亚基蛋白可能通过调节BKCa功能活动参与DGP的发生。     

足月妊娠PGF2α及其受体表达与引产成功率的关系

目的研究足月妊娠子宫平滑肌与蜕膜组织中前列腺素F2α(Prostaglandin F2α,PG F2α)的浓度、子宫平滑肌中PGF2α受体(PG F2α recepor,PTGFR)蛋白的表达与缩宫素引产成功率的关系。方法选择缩宫素引产成功与缩宫素引产失败的孕妇,于剖宫产术中取子宫平滑肌及子宫蜕膜组织。分别行ELISA法检测组织匀浆中PGF2α的浓度,Western blot检测子宫平滑肌中PTGFR蛋白的表达。结果ELISA法证明缩宫素引产成功组子宫平滑肌、子宫蜕膜组织中PGF2α浓度显著高于缩宫素引产失败组(P0.01);Western blot检测证明缩宫素引产成功组子宫平滑肌组织中PTGFR蛋白的表达也明显高于缩宫素引产失败组(P0.01)。结论子宫平滑肌与蜕膜组织中PGF2α浓度、子宫平滑肌组织中PTGFR蛋白的表达量与缩宫素引产成功率关系密切。     

血管平滑肌收缩的调节机制

Hartshere(1978)和Mikawa(1977)分别从血管平滑肌中发现了钙调蛋白(calmodulin,CaM)和平滑肌张力素(leiotonin)二种调节蛋白。继而,平滑肌肌球蛋白轻链(MLC)和其磷酸化过程中一些特异激酶(如肌球蛋白轻链激酶和依赖于cAMP的蛋白激酶)的功能又得到了进一步阐明。     

ERK在慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的：观察细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)在慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞的表达，以探讨ERK信号通路在气道平滑肌增殖中的作用。方法：病理图像分析慢性哮喘大鼠气道重塑，免疫组化法检测ERK和PCNA在肺内表达，激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2和PCNA在气道平滑肌的共表达，免疫印迹和原位杂交检测气道平滑肌中ERK和PCNA蛋白以及mRNA的表达。结果：慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚，出现结构重塑。ERK和PCNA在肺内表达增强，同时在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。结论：ERK可能是介导慢性哮喘气道重建中平滑肌增殖的重要信号通路之一。     

氧化型胆固醇下调血管平滑肌细胞金属蛋白酶组织抑制剂基因表达

目的：研究氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响。方法：离体培养免主动脉血管平滑肌细胞，分别用胆固醇、Triol与25-OH负载细胞，狭缝杂交测定TIMP-1mRNA表达，细胞免疫化学测定MMP-9与ITMP-1蛋白表达。结果：Triol与25-OH(1mg/L,24h）抑制TIMP-1 mRNA及蛋白表达，对MMP-9蛋白表达无影响。结论：氧化型胆固醇可以下调血管平滑肌细胞TIMP-1基因表达。     

连接子蛋白43(Cx43)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞自噬

目的 探讨连接子蛋白43(Cx43)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)自噬中的作用。方法 采用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光细胞化学染色鉴定原代VSMC, ox-LDL处理后,采用油红O染色鉴定泡沫细胞;Western blot法检测(0、 40、 80、 160)μg/mL ox-LDL处理0、 6、 12、 24 h, VSMC中微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达以及80μg/mLox-LDL干预24 h,Cx43蛋白的表达;将VSMC随机分为对照组、ox-LDL组和ox-LDL联合Cx43特异性阻断剂Gap26组,Western blot法检测各组细胞LC3、beclin 1的表达。结果 分离的细胞α-SMA阳性率达95%以上,与对照组相比,ox-LDL处理的细胞油红O阳性细胞明显增加,ox-LDL呈浓度依赖及时间依赖地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达,Cx43蛋白的表达明显升高;给予Gap26后,可上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达。结论 Cx43抑制ox-LDL引起的自噬。