两种HBV—DNA荧光定量PCR检测试剂比较

目的比较及评价两种HBV—DNA荧光定量PCR试剂特异性、灵敏度、重复性及检测结果的相关性。方法用深圳匹基生物工程有限公司生产的两种HBV—DNA荧光定量PCR试剂（试剂A,试剂B）对已知结果的质控血清、标准品及本院154份HBsAg阳性的临床标本进行平行检测,比较两种试剂检测结果的特异性、灵敏度、重复性及结果的相关性。结果试剂A与试剂B的特异性均为100％,灵敏度分别为90．91％和95．45％,符合率分别为93．33％和96．67％;对强阳性、临界阳性标本,试剂A重复性试验批内CV值为3．16％、5．61％,批间为3．18％、6．32％。试剂B批内CV值为2．11％、5．36％,批间CV为3．58％、4．59％;两种试剂对临床标本的检测结果相关性良好（r=0．93、P〈0．01）,但试剂A检测的灵敏度和符合率均低于试剂B（P〈0．01）。结论试剂B总体性能优于试剂A,适于临床使用;试剂A有待校准及（或）改进。实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂以保证检验质量。     

荧光微量检测细胞内DNA与蛋白质含量

应用荧光试剂（３３２５８Ｈｏｅｃｈｓｔ）微量测定细胞内ＤＮＡ含量,应用荧光胺（Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）微量测定细胞内蛋白质含量。结果：荧光试剂与ＤＮＡ的Ａ－Ｔ碱基形成复合物后,其激发波长（ＥＸ）由３２０ｎｍ移至３５０ｎｍ,发射波长（ＥＭ）由４８０ｎｍ移至４６０ｎｍ,且荧光强度大为增强。荧光胺与蛋白质反应生成强荧光化合物,在ＥＸ３９０ｎｍ,ＥＭ４７５ｎｍ条件下最低检测限为０．５μｇ／μｌ。该法操作简便,微量快速,重复性好。可用于荧光微量测定ＤＮＡ与蛋白质含量,还可用于观察细胞的增殖。     

Fluorometric detection of serotonin and serotonin-O.P.T.

Specifications and blank evaluations for the spectrophotofluorometric detection of serotonin and serotonin after reaction with ortho-phthaldialdhyde (O.P.T.) are presented. Sensitivity (detection limit) and precision for the serotonin-direct method were 55.9 ng./ml. and 2.7 ng./fluorescence intensity unit, respectively. There was a linear relationship between serotonin concentration and fluorescence produced in the range 2,797 ng./ml. to the detection limit. Blank fluorescence was composed of scattering, reagent, reagent and glassware contaminants and tissue components. The largest and most variable of these exhibited a peak of maximal fluorescence at ca. 400 nm. wavelength. It arose primarily from glassware and reagent contaminants and was not easily controllable. The blank altered the height and configuration of the serotonin spectrum producing atypicallity and resulting in inability to obtain an accurate reading for the serotonin component. No single common blank could be produced or described for correction of all specimens. The tissue blank for mid-jejunum was less than 0.2% of gross serotonin fluorescence at 545 nm. wavelength. Computer analyses indicated that the serotonin-O.P.T. blank was composed of peaks at the following wavelengths: 389, 407, 426, 448, 474 and 507 nm. A single chloroform wash was found to remove blanks peaking at 389, 426 and 474 nm. wavelengths eliminating atypicallity and permitting a more accurate reading of serotonin-O.P.T. at 473 nm. wavelength. A common reagent blank was also achieved. The chloroform wash produced a 17% loss of serotonin-O.P.T. Computer analyses further indicated that the characteristic serotonin-O.P.T. peak at 473 nm. wavelength was a composite of peaks at 459 and 490 nm. The use of O.P.T. permitted the fluorometric detection of serotonin down to a concentration of 12.3 ng./ml. with a precision of 0.1 ng./fluorescence intensity unit, and with standard linearity from 313 ng./ml. to the detection limit. These specifications represented 4.5- and 27.3-fold increases in sensitivity and precision, respectively, over the serotonin-direct method. The use of O.P.T. with a chloroform wash increased detection sensitivity to 75 ng./ml.; precision remained unaffected.     

稳定表达的人自身免疫调节因子HeLa细胞的建立及鉴定

目的 :建立稳定表达人自身免疫调节因子 ( autoimmune regulator,AIRE)的细胞株。方法 :用 Fu GENE6转染试剂将含 AIRE c DNA的真核表达载体转染 He La细胞 ,经 G41 8筛选阳性克隆。继续培养 4周 ,用荧光显微镜观察、流式细胞仪 ( FACS)检测和免疫印迹法检测 AIRE基因在 He La细胞中的稳定表达情况。结果 :经荧光显微镜、流式细胞仪及免疫印迹法检测 ,证实 AIRE基因得到了稳定表达。结论 :在 Fu GENE6转染试剂的介导下 ,AIRE基因在 He La细胞内获得稳定表达     

CGE（N）的合成及其在荧光分析法中的应用

设计和合成了一种具有荧光团，并能与含活泼氢的化合物反应的新型荧光剂４－氯萘基缩水甘油醚［ＣＧＥ（Ｎ）］，且对其结构进行了鉴定。同时研究了该新型荧光剂在溶液荧光分析法中的应用。结果显示：ＣＧＥ（Ｎ）在溶液荧光分析法中，是一种好的分析试剂，成功的检测了山慈姑中秋水仙碱的含量，有较广泛的适用性。     

带有CFP标签的LC3自噬表达载体的构建

目的构建带有樱桃红色荧光蛋白(cherry fluorescent protein,CFP)标签的微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法采用PCR方法,从质粒载体pCMV-GFP-LC3为模板扩增LC3片段,通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物LC3与经过ApaI和BamHI双酶切的pm-cherry-c1载体连接,命名为PM-CFP-LC3。该载体经酶切及测序验证后,在fugene6转染试剂介导下转染293细胞,通过荧光显微镜观察CFP在细胞内的分布来观察LC3表达情况。结果带有CFP标签的LC3表达载体构建成功,在荧光显微镜下可观察到转染细胞中樱桃红色荧光以及细胞自噬现象。结论成功构建了带有CFP标签LC3的重组质粒并成功表达,为深入研究细胞的自噬奠定了实验基础。     

微波消解-氢化物原子荧光光谱法测定海产品中痕量汞

目的建立微波消解-氢化物原子荧光光谱法测定海产品中痕量汞的方法。方法采用微波消解法对几种常见海产品进行前处理,用氢化物-原子荧光光谱法测定海产品中痕量汞。结果微波消解过程中,选择硝酸+双氧水消解试剂,汞在浓度0～10μg/L范围内线性关系良好,相关系数r=0.9 992,检出限为0.02μg/L,测定汞1.0μg/L标准溶液RSD为1.88%。测定国家标准物质对虾(GBW08572)RSD为2.5%,且测定结果与标准含量一致。结论该方法简便快速、准确灵敏,适合于海产品中痕量汞的测定。     

液氮保存细胞表面抗原的流式细胞仪分析

在免疫学研究中,用间接免疫荧光技术检测细胞表面抗原是鉴别细胞种类及细胞亚群分析中常用的方法。近年来,用流式细胞仪替代荧光显微镜以检测细胞表面抗原日益增多。但在临床样品检测中常因仪器或其它原因,不能立即检测,而需把细胞(如外周血单一核细胞)先贮存于液氮中.但液氮冻存细胞常使部分细胞死亡.由于荧光素标记物能穿过死亡细胞壁进入细胞,造成假阳性,使测得值不够准确。因此,如何排除死亡细胞的干扰,成为用流式细胞仪检测液氮冻存细胞表面抗原的一个重要问题。为排除样     

荧光分光光度法测定十种中药微量元素硒的含量

硒(Se)是人体健康超微量必需元素。研究表明人体缺硒是癌症发病病因之一。考虑到硒的特殊抗癌生理功能,我们选择了临床床上常用的十种中药,用2,3-二氨基萘(2,3-diaminona phthalene,简称DAN)作为荧光试剂,应用荧光分光光度法测定了其中硒的含量。     

抗-HCV ELISA法检测结果在临界值附近的风险探讨

目的应用化学发光免疫分析（CLIA）法,检测抗-HCVELISA法结果在临界值附近（O．4≤S／CO〈1）的血清标本,探讨HCV感染的风险性。方法笔者对19份抗-HCVELISA法检测结果在临界值附近,胶体金法均阴性的血液标本,分别经抗．HCVELISA法试剂①、试剂②、胶体金法和CLIA法试剂进行了检测。结果HCV-CLIA法阳性16份、ELISA法试剂①和试剂②分别阳性5份9份,胶体会法阳性0份。cuA法与ELISA法和胶体金法比较检出率灵敏度显著高于ELISA法（P〈0．05或P〈0．01）和胶体金法（P〈0．01）。结论抗-HCVELtSA法检测结果在临界值附近的血液标本存在HCV感染的可能．尤其是献血者标本存在感染受血者的风险。对可疑标本应更进一步的应用丙型病毒性肝炎核心抗原检测法、CLIA法、核酸扩增和微流芯片法或RNART—PCR荧光定量法进行检测,以保证结果的准确性。     

单克隆抗体与血卟啉衍生物交联物的制备及其对胃癌靶细胞的杀伤作用

以碳二亚胺(EDCI)为连接剂,将血卟啉衍生物(HPD)与抗胃癌单克隆抗体18M(McAb18M)共价交联。经ELISA法测定及溶血试验表明,该交联物保留了McAb的反应特性及HPD的光故活性。体外试验表明,交联物对靶细胞的光动力杀伤效率提高了11.2倍,对非靶细胞的杀伤作用微弱,表明HPD—McAb具有特异杀伤作用。对游离HPD及交联HPD的吸收光谱,荧光激发光谱及发射光谱的分析比较表明,二者均有一定的差异。     

荧光分光光度法测定复方甲基炔诺酮片中炔雌醇的含量

本文应用荧光分光光度法测定复方甲基炔诺酮片中炔雌醇的含量。方法系根据Kober反应的基本原理,采用混合试剂[硫酸-水(3:1) 0.5％(W/V)对苯二酚]激发荧光,荧光强度比较稳定,再现性较好,甲基炔诺酮和辅料基本不干扰,平均回收率的标准偏差低于4％。本法比过去的方法简便迅速且适用于单片分析。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

Construction of GFP-AWP1 fusion gene vector and its expression in 293 cells]

OBJECTIVE: To construct green fluorescent protein (GFP)-AWP1 (a novel human protein associated with protein kinase C-related kinase 1) fusion gene vector for observing the expression and localization of AWP1 in 293 cells. METHODS: The coding region in AWP1 cDNA was amplified by RT-PCR from human endothelial cell line ECV304 and recombined into pEGFP-C2 plasmid expressing GFP. After identification with restriction endonucleases and sequence analysis, the recombinant plasmid was transfected into 293 cells with the cationic liposome DOTAP as the transfection reagent. The expression and localization of AWP1 were observed under a fluorescence microscope. RESULTS: Restriction endonuclease assay and sequence analysis verified the successful construction of the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1, and GFP-AWP1 fusion protein was highly efficiently expressed in 293 cells. Under fluorescent microscope, green fluorescence was seen homogeneously distributed in the entire cell body of the cells transfected by the empty vector pEGFP-C2, but diffusely in the cytoplasm of the cells transfected by the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1. CONCLUSION: GFP-AWP1 fusion gene vector is successfully constructed and the fusion protein expressed in the cytoplasm of 293 cells.     

流式细胞仪自动化快速初筛环磷酰胺诱导微核作用的研究

目的 利用单一荧光试剂吖啶橙（acridine orange, AO）和简单的单激光流式细胞仪计数骨髓嗜多染红细胞细胞的微核率,达到了解化合物诱导微核作用的目的。方法 采用经典的染色体断裂剂环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)腹腔注射小鼠和大鼠,24h后采集骨髓细胞,经过固定和吖啶橙（acridine orange, AO）荧光染色,利用单激光流式细胞仪计数微核,计数结果用WinDMI软件进行分析,作出等高图并设置窗口。结果 随着CP浓度的增高,骨髓细胞的含微核的嗜多染红细胞（micronucleated PCE, MNPCE）也相应增多,呈良好的量效关系。实验结果同时和手工计数比较,没有显著差异。结论 采用单一荧光染色（AO染色）和单激光流式细胞仪快速初筛化合物诱导微核作用是可靠的,较传统的手工方法更为灵敏,并节省了大量时间和成本,操作也更为简单。     

固相简易荧光花环法检测人smIgG~ B细胞的研究

本文报道检测SmIgG~ B细胞的固相简易荧光花环法,30例正常人检测结果表明,该花环法较DIF法敏感(P<0.001),因不受外源性IgG和FC受体的影响,试剂制备简单、经济和稳定,标本至少可保存3个月。是一值得推广应用的检测B细胞SmIgG的有效方法。     

HBV血清标志物e抗原假阴性的原因分析及对策

目的:分析ELISA法检测乙型肝炎病毒(HBV)标志物e抗原(HBeAg)出现假阴性的原因并探讨应对措施,防止HBeAg阳性漏检.方法:凡用ELISA法检测的HBV标志物5项指标结果为表面抗原(HBsAg)和核心抗体(抗-HBc)阳性(俗称1、5阳性)而HBeAg为阴性的,应用4家试剂2种方法联合复检HBeAg确认结果.具体措施:(1)对每天用A试剂检测的HBV标志物5项指标测得结果仅1、5阳性的样品,用A、B、C试剂(ELISA法)联合复检HBeAg.(2)无论A、B、C哪种试剂,只要HBeAg复检结果为阳性、弱阳性或样品测定D值在灰区范围的,必须用D试剂(化学发光法)进一步复检确认阳性,以D试剂复检结果为最终确认结果.结果:274份样品用A、B、C试剂复检HBeAg(室内质控值在控),A试剂结果仍然全部阴性,阳性漏检率为2.18%,B试剂结果5例阳性,阳性漏检率为0.36%,C试剂结果6例阳性(5例阳性与B试剂复检样品号码相同,1例A、B试剂复检为阴性C试剂复检为阳性),无阳性漏检.复检6例HBeAg阳性的样品用D试剂复检确认仍为阳性,无阳性漏检.结论:ELISA法A、B试剂存在比例不等的HBeAg假阴性.在日常工作中,对ELISA法测定的HBV标志物5项指标仅1、5阳性的样品结果,严格多家试剂联合复检HBeAg是非常必要的.     

微波消解-冷原子荧光分析法测定泽泻和南板蓝根的痕量汞

目的 建立泽泻、南板蓝根中痕量汞的测定方法.对样品的前处理方法和仪器工作条件进行探讨和优化.方法 采用硝酸-氢氟酸-过氧化氢体系微波消解-冷原子荧光法测定闽产中药建泽泻、南板蓝根中痕量汞.结果 平均回收率95.6%～104.8%,精密度＜3.5%.仪器工作参数:测定波长253.7 nm,负高压410 V,载气流量1.5 L/min,屏蔽气流量0.1 L/min,进样量0.5 L/min,样品还原时间40 s.结论 建立的微波消解-冷原子荧光法方便、快捷、准确,可用于南板蓝根、泽泻中痕量汞测定.     

基于R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法的高危型人乳头瘤病毒基因型微量检测

  目的  使用R6G-ddATP作为双脱氧荧光底物建立单碱基末端延伸（SNaPShot）-凝胶荧光法快速检测3种高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）（HPV18、HPV33、HPV35）基因型。  方法  使用HPV质控品作为样本,R6G-ddATP双脱氧荧光试剂作为底物,首先利用通用引物对HPV进行扩增,得到第一轮扩增产物,经纯化后作为后续SNaPShot反应的模板;然后利用特异性的一步延伸引物进行SNaPShot反应,生成带有R6G荧光标记的DNA延伸产物;产物经过琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪下观察电泳结果,通过不同的一步延伸引物对HPV进行分型。每个样本均重复检测3次,并与DNA测序结果进行比较。  结果  优选的SNaPShot反应的退火温度为55℃;仅需3 h即可对HPV进行分型;在该最适条件下使用R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法检测3种HPV基因型,检测结果与测序结果一致。  结论  成功建立了3种HR-HPV基因型的微量检测方法——R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法,可用于HPV基因型的快速检测。     

Fudenine——一个新的与血糖调节相关的膜蛋白

目的：确定Fudenine是否为一个新的膜蛋白。方法：用绿色荧光蛋白（GFP）对Fudenine进行体内定位，以GFP（一种代谢稳定的蛋白）定位于细胞质中，作为对照, 将融合质粒Fudenine-GPF肯时转染CBRH7919和L－6TG两种细胞，48h后荧光显微镜下观察。结果：报告质粒GFP表达产物定位于胞质中，而融合质粒产物定位于细胞膜上。结论：Fudeinine是一种膜蛋白，它可能与其同源基因prominin和AC133的抗原有相似的功能，在血糖调控和信号转导等方面发挥作用。