人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因，并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因，与TA载体连接后进行核酸序列测定．并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220，在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因，其cDNA序列与献报道的一致，构建了重组质粒pBV220-OB，并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用，以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因,并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因,与TA载体连接后进行核酸序列测定,并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220,在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因,其cDNA序列与文献报道的一致,构建了重组质粒pBV220-OB,并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用,以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定

目的 在大肠埃希菌(E. coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性.方法 采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E. coli BL21(DE3),温控诱导表达目的 蛋白NK4.蛋白鉴定采用SDS-PAG...     

Purification and immunity analysis of recombinant 6His-HPT protein expressed in E. coli

Objective To obtain HPT protein (Hygromycin B Phosphotmnsferase), a kind of plant selective maker gene product expressed from E.coli and to prepare the polyclonal antibody (pAbs) against it. Methods HPT cDNA fragment was obtained by PCR and was inserted into the prokaryotic expressing vector pBV222. Then the constructed recombinant plasmid pBV222-HPT was transfered into E.coli DH5α for HPT expression. The recombinant expressing system was confirmed by restriction endonuclease digestion, DNA sequencing and protein expression. E.coli cells were lysed by sonication and detergent dissolution. After cell membrane was extracted, the inclusion bodies were denatured by 8 mol/L Urea and purified with metal chelate affinity chromatography on Ni-NTA agarose under denaturing condition. The purified 6His-HPT was characterized by SDS-PAGE, and used to immunize rabbit. The titer and specificity of antisera were detected by ELISA and Western blot respecitively. Results Analysis of DNA sequence and restricted enzymes showed that the sequence of PBV222-HPT plasmid was correct. The amount of recombinant HPT expressed in E.coli accounted for 30% of total cellular proteins. From 1 liter of fermentative bacteria about 22 milligrams of pure recombinant HPT was isolated with purity above 95%. The recombinant HPT protein could produce high titer antiserum in rabbits and show good immunity activity. Western blot showed specific binding reaction between the antiserum to the purified 6His-HPT protein and their expressed products (plants protein and bacterial protein). Conclusion HPT protein can be expressed and purified from E.coli by a relatively simple method, which has high immunity activity.     

Purification and Immunity Analysis of Recombinant 6His-HPT Protein Expressed in E.coli

INTRODUCTION Selective marker genes are important for the production of genetically modified organisms (GMOs), and they are essential for the selection of modified cells at relatively low frequencies[1]. Marker genes are used to 搕ag?genes of interest and comprise several classes. Antibiotic resistance gene is one of the most commonly used markers in the modification process. The enzyme Hygromycin B Phosphotransferas (HPT) is a widely used selective marker in various animal a…     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA．并构建成pBV220-survivin原核表达质粒，将其导入Ecoli Bl21(Gold)中，诱导表达survivin蛋白。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Western blotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致，表达质粒在E-coli Bl21(Gold)中得到高效表达，表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白，其纯度达到95％以上。Western blotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白。为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

p21waf1基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建人p21^waf1基因的原核表达载体并在大肠杆菌JM109中高效表达。方法:从人肝细胞中分离总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到p21^waf1全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV220/p21^waf1重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化到大肠杆菌JM109进行表达、初步纯化。 结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量21 000处有一诱导蛋白带,薄层扫描显示表达产物在诱导5 h时可达细菌总蛋白的38%,Western blotting证明表达产物与抗人P21^waf1单克隆抗体有特异性免疫反应。 结论:成功构建出p21^waf1表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为P21^waf1蛋白。     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

人肝细胞生长因子β链基因的克隆及表达载体的构建

目的 构建重组人肝细胞生长因子－β（rhHGF-β)的克隆表达体系。以期进一步研究HGF基因的表达调控及HGF的生物学、医学作用。方法 从人胎肝细胞中提取总RNA,运用RT－PCR技术,对HGF－β基因转录前加工修饰,与载体重组,构建rhHGF-β的克隆,并对克隆进行限制性内切酶酶切图谱分析,对重组体中插入的外源基因进行序列分析。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组体克隆的酶切结果与设计一致。结论 首次成功地构建了人肝细胞生长因子－β（rhHGF-β）的克隆表达体系。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

hKGF 2在不同原核载体中的构建、表达和纯化分析

目的 比较人角质细胞生长因子2（hKGF2）在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法 RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后，分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接，转化不同宿主菌进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot进行蛋白鉴定。针对不同原核表达载体分别用阳离子交换层析和镍亲和层析（Ni-NTA）纯化目的蛋白，电泳分析蛋白纯化结果，并分别检测其生物学活性。结果 目的基因片段克隆入pBV220载体后在E.coli JM109中表达量最高，约占菌体总蛋白的15%；克隆入pET-30a(+)载体在E.coli BL21（DE3）中表达量约占菌体总蛋白的25%；均为可溶性表达，不同方法纯化后蛋白纯度达95%以上，均能有效促进人胚胎肾上皮细胞增殖。结论 hKGF2基因在不同的宿主菌中蛋白表达不同，以融合蛋白表达纯化效果更好。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

构建靶向杀伤白血病细胞的新型重组白细胞介素6D24-PE40KDEL融合蛋白

目的　构建能高度特异地靶向杀伤高表达白细胞介素 6受体 (IL 6R)白血病细胞的新型重组IL6 PE4 0KDEL(绿脓杆菌外毒素 )融合蛋白。方法　通过定点诱变将绿脓杆菌外毒素PE4 0基因羧基端最后 5个氨基酸REDLK替换成内质网蛋白滞留序列 (KDEL) ,采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的人IL6 (IL6D2 4 )cDNA与PE4 0KDEL基因进行重组融合构建 ,利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统实现该新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱层析纯化后 ,以四甲基偶氮唑类似物 (MTS)法检测IL6D2 4 PE4 0KDEL的靶向杀伤活性。结果　构建的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 4 0 %左右 ;经包涵体分离、复性、变性及纯化所得该融合蛋白纯度 >95 % ;纯化的融合蛋白能与IL6抗体及绿脓杆菌外毒素A(PEA)抗体发生特异性结合 ;IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL6R的U937细胞 ,IC5 0约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL6R的人T淋巴白血病细胞系则无杀伤作用。结论　成功构建了具有靶向杀伤高表达IL6R白血病细胞的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白 ,为深入地探索利用IL6 /IL6R系统介导靶向治疗高表达IL6R白血病奠定了坚实的基础。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

人IL—2cDNA的亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建重组人IL－2表达质粒并观察其在大肠杆菌中的表达效率。方法应用重组DNA技术，将人IL一2cDNA亚克隆于pKK223－3表达载体，构建成pKK223－3－IL－2重组表达质粒，转化JM105受体菌后得到工程菌，命名为JM105／PKK223－3－IL－2。结果凝胶电泳和核酸杂交证实，人IL一2cDNA已成功地插入到pKK223－3质位的EcoRI－HindIII位点。在异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导下，工程菌中重组人IL－2表达效率为26％；诱导8h，IL－2的产量达峰值；用含TritonX100的缓冲液反复洗涤，获得纯度很高的包含体。结论人IL-2cDNA在tac启动子控制不能在大肠杆菌中高效地表达人IL-2。     

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ｈＳＣＦ）,提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及ＰＣＲ技术,改变人工干细胞因子ｈＳＣＦ ｃＤＮＡ起始密码子ＡＴＧ与ＳＤ序列之间的距离及在翻译起始区（即Ｎ端氨基酸）部分采用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）喜用型密码子的策略,使重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｈＳＣＦ在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效稳定表达。结果 ＤＮＡ序列测量证明基因     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因修饰及其在大肠杆菌中 …

目的 对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＧＭ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ５′端进行修饰以实现在大肠杆菌中的高效表达。方法 采用ＰＣＲ方法进行插入和定点突变,转化大肠杆菌实现原核系统表达。通过细胞和生物学方法对表达产物进行鉴定。结果 修饰后基因的氨基酸序列与文献报道完全一致,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的２５％;重组蛋白可