人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系耐药与凋亡相关基因表达差异及其相关性

目的 探讨人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系A549和A549^DDP耐药及凋亡相关基因表达的差异，以及多药耐药的发病机制。方法 采用逆转录-PCR及免疫细胞化学方法检测A549和A549^DDP细胞多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、bcl-2及C-erbB-2的表达水平。结果 逆转录-PCR结果显示：A549细胞表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，无LRP mRNA表达，A549^DDP细胞亦表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，且表达LRP mRNA，耐药细胞MRP及C-erbB-2mRNA表达水平较亲代显增高，bcl-2mRNA表达水平与亲代无显性差异(P=0．731)；A549^DDP细胞血管生成因子及耐药相关基因mRNA表达水平较A549细胞显增高，差异有显性(P=0．007)。免疫细胞化学结果显示：亲代和耐药细胞bcl-2蛋白表达呈强阳性，亲代C-erbB-2及LRP呈阴性，MRP轻度阳性，耐药细胞MRP蛋白呈中度阳性，C-erbB-2及LRP轻度阳性。结论 A549细胞的原发耐药与耐药及凋亡相关基因MRP、C-erbB-2和Bcl-2的异常表达和协同作用有关。A549^DDP细胞MRP和C-erbB-2的表达增强，且表达LRP，可能是继发耐药的产生机制。     

白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素12(IL-12)对肺腺癌细胞作用机制的研究

目的:探讨人肺腺癌A549/DDP的多药抗药机理。方法:采用四氮唑盐快速比色法(MTT法)进行体外细胞毒性实验;免疫组化方法检测A549及A549/DDP在细胞因子作用前后突变型P53、bc l-2、MDR1的表达。结果:IL-2与顺铂合用前顺铂对两株细胞的毒性作用无明显变化;IL-12与顺铂合用后顺铂对两株细胞的毒性作用明显增强;IL-2、IL-12与顺铂合用后顺铂对两株细胞的毒性作用进一步增强。免疫组化结果显示:IL-2作用于两株细胞后,突变型P53、bc l-2、MDR1的表达无明显变化;IL-12作用于两株细胞后,bc l-2、突变型P53、MDR1的表达均下调,IL-2能增强上述作用。结论:IL-12与顺铂具有协同抑制肺腺癌A549细胞的作用,IL-12能增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,IL-2能进一步增强上述作用。     

三氧化二砷对人肺腺癌细胞A549/DDP裸鼠体内的多药耐药逆转作用

目的研究三氧化二砷（As_2O_3）对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/顺铂（DDP）裸鼠移植瘤的耐药逆转作用。方法建立人肺腺癌裸鼠移植瘤模型,观察As_2O_3、DDP及联合用药对体内移植瘤生长状况的影响;采用流式细胞术（FCM）测定不同用药对肿瘤细胞凋亡率变化和耐药细胞A549/DDP P-糖蛋白（P-gp）表达;采用RT-PCR检测不同用药对A549/DDP移植瘤组织MRP1-mRNA和LRP-mRNA表达的变化。结果体内裸鼠抑瘤实验显示As_2O_3有一定抑瘤作用,联合应用DDP可显著抑制肿瘤生长。FCM结果显示应用As_2O_3后肿瘤细胞平均凋亡率,明显高于对照组（P〈0.05）[（17.204±3.091）%vs（3.436±0.537）%],低浓度As_2O_3联合DDP后肿瘤细胞的凋亡率,明显高于DDP组（P〈0.05）[（14.472±3.891）%vs（5.612±1.167）%]。FCM对P-gp表达检测提示As_2O_3对移植瘤Pgp水平无影响。RT-PCR检测结果示含As_2O_3组MRP1表达明显低于不含As_2O_3组（P〈0.05）,肺癌耐药相关蛋白（LRP）在转录水平呈现相对低表达,含As_2O_3组同不含As_2O_3组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 As_2O_3能在体内逆转A549/DDP细胞的耐药性,其机制可能是As_2O_3可通过下调MRP1基因表达,提高A549/DDP细胞对DDP敏感性逆转其耐药,并可能通过诱导肿瘤细胞凋亡来起作用。     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

多药耐药细胞系A549/ADM的建立及部分特性

目的建立多药耐药细胞系A549/ADM和初步探讨人肺腺癌细胞多药耐药的发生。方法对肺腺癌细胞A549采用持续低浓度和逐渐增加阿霉素浓度间歇诱导,建立多药耐药细胞系;使用流式细胞仪器分别检测敏感细胞系和耐药系的P-gp和MRP的表达;采用MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度。结果与母细胞系相比,耐药细胞系A549/ADM对ADM的耐药程度增加了14.29倍,对VCR、DDP、VP-16均有不同程度的耐药,对5-FU无耐药性;耐药细胞系A549/ADM表面P-GP、MRP表达分别为74.8%和61.2%(P<0.01)。结论A549/ADM对多种常用肿瘤化疗药物表现有不同程度的耐药,其耐药性可能与P-GR和MRP高表达有关。     

贝伐单抗对荷耐顺铂人肺腺癌A549/DDP裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的 探讨贝伐单抗联合或不联合顺铂对耐顺铂肺腺癌A549/DDP移植瘤生长的抑制作用.方法 建立裸鼠移植瘤模型,随机分成空白对照组(A组)、单药贝伐单抗组(B组)、单药顺铂组(C组)、联合用药组(D组)和联合半剂量组(E组)5组,连续用药4周.观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率;免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度(MVD);RT-PCR分析各组经治疗后凋亡基因bcl-2及耐药基因(LRP、GST-Π)mRNA表达情况.结果 与空白对照组比较,经贝伐单抗治疗组(B、D、E组)抑瘤率分别为20.96%、51.67%、50.95%,联合用药组(D、E组)效果最佳.经贝伐单抗治疗组微血管密度分别为18.6±1.14、13.6±1.14、14.4±0.55,联合用药组最为显著,而单药顺铂组与对照组在抑瘤率和微血管密度表达上均无差异(P=0.632).经贝伐单抗治疗组bcl-2 mRNA表达较对照组有显著差异(P＜0.001),但三组之间无差异(P＞0.05);五组之间在LRP、GST-Π mRNA表达上无明显差异(P＞0.05).结论 贝伐单抗对荷A549/DDP裸鼠移植瘤有抑制作用,联合顺铂用药有显著协同作用,同时提高A549/DDP耐药细胞对顺铂的敏感性,其作用机制可能与抑制肿瘤微血管形成、诱导细胞凋亡增加有关.     

去甲斑蝥酸钠对耐顺铂肺腺癌A549／DDP细胞逆转的分子机制

目的探讨去甲斑蝥酸钠（SNCTD）对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549／DDP的逆转作用及可能分子机制。方法（1）采用CCK法筛选出SNCTD对A549／DDP的无毒浓度（即对细胞抑制率〈10％的药物浓度）,并检测出顺铂及与无毒浓度SNCTD联合对耐药细胞株的半数抑制浓度（IC50）;（2）采用流式细胞仪分别检测1、2倍无毒浓度SNCTD对细胞内罗丹明123的蓄积情况;（3）采用逆转录-多聚酶链反应（RT—PCR）检测1、2倍无毒浓度SNCTD处理细胞48h后耐药相关基因mdr1mRNA、MRP1mRNA、GST—PimRNA表达,并检测药物处理72h后GST—PimRNA的表达。结果（1）SNCTD对A549／DDP的无毒浓度为5μg／ml,无毒浓度SNCTD与顺铂联合应用可使A549／DDP细胞对顺铂的IC50值下降为4．32μg／ml,逆转倍数为1．97倍;（2）无毒浓度SNCTD处理耐药细胞48h后细胞内罗丹明123荧光强度明显增强（P〈0．05）;（3）5、10μg／ml SNCTD处理耐药细胞株48h后mdr1 mRNA、MRP1 mRNA表达均明显减弱（P〈0．05）,而且10μg／ml SNCTD处理组减弱强度亦明显大干5μg／mlSNCTD处理组（P〈0.05）,呈现浓度依赖性;而GST—PimRNA表达并无明显变化（P〉0．05）,72h后GST—PimRNA表达也未出现下降（P〉0．05）。结论SNCTD可以逆转A549／DDP细胞的耐药作用。其作用机制可能与下调耐药相关基因mdr1、MRP1的表达,影响膜蛋白外排泵功能有关。     

靶向Ku70基因siRNA对人肺腺癌细胞顺铂耐药性的逆转作用

目的：研究Ku70与人肺腺癌耐药的相关性,观察调控Ku70表达能否逆转人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）的耐药性。方法：采用RT-PCR、Western Blotting方法比较Ku70在人肺腺癌亲代细胞（A549）与耐药细胞系（A549/DDP）的表达水平。转染靶向Ku70基因siRNA（si-Ku70）的A549/DDP细胞作为实验组,转染非特异性siRNA（si-Scramble）的A549/DDP细胞作为阴性对照组,同时设空白组(A549/DDP细胞)。加药组在转染后48 h给予顺铂。应用MTT法检测各组细胞在顺铂作用下的生存率,并计算半数抑制浓度（IC₅₀）,采用流式细胞仪定量检测细胞凋亡率;采用分光光度法检测Caspase-3活化程度。结果：Ku70 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞表达水平显著高于其亲代A549细胞（P<0.01）;靶向Ku70的siRNA（si-Ku70)明显下调A549/DDP细胞的Ku70 mRNA和蛋白表达水平（P<0.01）;在不同浓度顺铂作用24 h后,实验组细胞的生存率明显低于阴性对照组和空白组（P<0.01）。6 mg/L顺铂作用24 h后,实验组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于阴性对照组和空白组（P<0.05）。结论：Ku70在人耐药肺腺癌细胞呈现高表达,提示Ku70参与肺腺癌耐药的形成;靶向Ku70siRNA导入人肺腺癌耐药细胞可特异性下调Ku70的表达,促进肺腺癌耐药细胞凋亡,逆转其耐药性,Ku70可能成为逆转肺癌耐药的一个新的分子靶点。     

携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。     

MicroRNA-98对A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨MicroRNA-98（miR-98）对肺腺癌耐顺铂细胞系A549／DDP顺铂耐药性的影响。方法利用MicroRNA（miRNA）芯片及生物信息学筛选出miR-98。将miR-98质粒载体瞬时转染至A549／DDP细胞：M．rr检测细胞药物敏感性的改变。结果在A549／DDP细胞中miR-98表达水平下调。转染miR．98的A549／DDP细胞生长抑制率明显增高。结论miR-98能够增加肺腺癌耐药细胞株A549／DDP对顺铂的药物敏感性。     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A_(549)~(DDP)

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lungadenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549DDP . Methods RT-PCR and immunohistochemistry was used to detect the mRNA and protein expressions of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and basic fibroblast growth factor ( bFGF) in A549 and A549DDP . Results VEGF and bFGF mRNA were expressed in A549 and in A549DDP VEGF and bFGF mRNA expression levels in A549DDP were significant higher than those in A549 (P< 0 .025 ). VEGF and bFGF protein expressions were all strong positive in A549 and A549DDP. Conclusion There are certain differences between VEGF and bFGF expressions in A549 and A549DDP . Drug-resistance of lung cancer is associated with those above genes over-expressions. Over-expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.     

CTR1和ATP7B在人肺腺癌细胞A549的表达及其与顺铂耐药的关系

目的  探讨人肺腺癌细胞株A549和肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的耐药机制。方法  利用噻唑蓝法检测顺铂对A549/DDP及其亲代细胞株的细胞毒作用和生长曲线的影响,探讨A549/DDP细胞株凋亡敏感性的变化规律。采用Western blot检测该细胞株铜离子转运蛋白1（CTR1）、铜离子转运磷酸化ATP酶（ATP7B）及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）剪切蛋白表达,分析A549细胞对顺铂耐药与CTR1、ATP7B及PARP剪切蛋白表达量的相关性。结果  A549/DDP较其亲代细胞株对顺铂引起的细胞毒性和凋亡敏感性下降;较其亲代细胞株A549/DDP中ATP7B表达增加,CTR1表达降低。结论  人肺腺癌细胞株A549对顺铂耐药的产生与细胞凋亡敏感性降低有关,且细胞内ATP7B表达增加,CTR1表达降低,或可作为细胞对顺铂的增敏靶点。

     

MT1X siRNA对肺癌A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨金属硫蛋白1X（MT1X）在肺癌耐药细胞株（A549／DDP）顺铂耐药中的作用。方法通过化学合成针对MT1X的siRNA段抑制其在A549／DDP中的表达,实时定量聚合酶链反应（PCR）及WB检测干扰效果,M1Tr及平板克隆形成实验检测干扰前后细胞对顺铂的药物敏感性变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果针对MT1X的siRNA片段能在RNA及蛋白水平有效抑制其在A549／DDP中的表达;与对照组相比,MT1X表达被抑制后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性明显升高;增殖被抑制,平板克隆形成率明显降低（P〈O．05）,细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）。结论针对MT1X的siRNA片段可部分逆转肺癌细胞（A549／DDP）对顺铂的耐受,为提高肺癌的化疗效率提供了一种新方法。     

联合应用以MRP和bcl-2为靶标的siRNA对鼻咽癌细胞耐药和凋亡的调节

[摘要] 目的 研究联合转染以MRP和bcl－2为靶标的siRNA后,鼻咽癌细胞株CNE2和耐药细胞CNE2/DDP的药物敏感性和凋亡率的改变。方法 以MRP和bcl－2为靶标的siRNA(均为100 umol/L)分别或联合转入顺铂处理的CNE2和CNE2/DDP以单纯化疗处理组和未处理组为对照。转染后24,48,72 h MTT法检测各组生长抑制率,计算IC50值。RT-PCR检测转染12 h各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,流式细胞仪检测转染48 h各组MRP和bcl－2蛋白表达率和细胞凋亡率。结果 细胞分别转染以MRP和 bcl－2为靶标的siRNA后,相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞的凋亡率生高,IC50均较单纯化疗组低,有统计学意义（P<0.05）,两者间也有统计学差异（P<0.05）;联合转染两种siRNA后细胞的IC50进一步显著下降,细胞凋亡率显著升高,与各组相比均有统计学差异（P<0.01）。结论 联合以MRP和bcl－2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率。 [关键词] Bcl-2 MRP siRNA 鼻咽肿瘤     

非小细胞肺癌多药耐药因子的表达相关性及临床意义

探讨多药耐药因子在肺癌中表达与共表达的相关性及其临床意义。方法:采用免疫组化SP技术检测52例肺癌患者病理组织中P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白(MRP)、谷胱甘肽S转移酶Ⅱ(GST-Ⅱ)3种多药耐药因子的表达水平。结果: 肺癌组织中P-gp、 MRP、GST-Ⅱ阳性表达率分别为51.9% (27/52)、61.5% (32/52)和78.8%（41/52）;耐药因子在不同病理类型、不同TNM分期和不同分化程度间表达差异无显著性(P＞0.05);P-gp和MRP均阳性40.1%,P-gp和GST-Ⅱ均阳性44.2%,MRP和GST-Ⅱ均阳性50.0%,P-gp、MRP和GST-Ⅱ均阳性21.2%,其中P-gp与MRP间阳性表达率呈正相关关系(r_s=0.632,P<0.01）,P-gp与GST-Ⅱ间阳性表达率呈正相关关系 (r_s=0.521,P<0.01）,MRP与GST-Ⅱ间阳性表达率呈正相关关系(r_s=0.532, P<0.01）。结论: 肺癌的多药耐药现象是由多个耐药因子共同参与作用的结果,肺癌多药耐药的发生与不同的病理组织类型、不同TNM分期、不同分化程度间无关联     

榄香烯对人肺癌A549细胞系耐顺铂细胞株多药耐药的改善作用及机制研究

[目的]探究榄香烯(elemene,ELE)对顺铂(cisplatin,DDP)耐药人肺癌A549/DDP细胞系多药耐药的改善作用及其作用机制.[方法]将A549/DDP细胞分为A549/DDP组和ELE组,以四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测24、48、72h时不同...     

金复康口服液对耐药人肺腺癌A549/DDP膜转运蛋白LRP MRPmRNA表达的影响

目的:从逆转多药耐药的角度,研究金复康口服液对耐药人肺腺癌细胞A549/DDP的化疗增效的作用和分子机制。方法:应用血清药理学方法,选择A549、A549/DDP细胞,实验分为实验组和空白对照组,从细胞水平、分子水平进行研究。结果:金复康口服液低剂量能够逆转A549/DDP对DDP的耐药,逆转耐药倍数为3.45倍,与DDP(320μmol/L)合用,使DDP(320μmol/L)对A549/DDP细胞的抑制率由47.55%升高为73.32%,且q>1.15,表明金复康口服液与DDP合用有明显的协同增效作用,增加了DDP对A549/DDP细胞的敏感度;金复康口服液低剂量能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。结论:(1)低剂量金复康口服液与DDP合用能够增加DDP对A549/DDP的增殖抑制作用,二者具有显著的协同增效作用。(2)金复康口服液能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。金复康口服液可能通过降低耐药肿瘤细胞膜转运蛋白的表达而逆转肿瘤多药耐药,为扶正方药对化疗增效机理提供了新的实验依据。     

重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721／ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒（Ad—Asmrp）,在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素（ADM）及柔红霉素（DNR）的半数致死量（IC50）并计算耐药倍数（RF值）;在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P。。表达、并用RT—PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0．487μg／ml、0．328μg／ml,RF值分别为97．4、109．3,RF值分别下降36．8和35．4。在转染后24h,MRPmRNA水平开始下降并呈持续下降趋势（P〈0．01）,48h后伴有P190蛋白表达的持续下降（P〈0．01）,二者趋势一致。转染后48h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升（P〈0．01）。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。