维持性血液透析患者外周血中性粒细胞预激活gp-91phox基因表达和吞噬杀菌功能异常

目的　探讨维持性血液透析 (HD)患者机体免疫功能下降的原因。方法　用RT PCR方法 ,对HD患者和正常对照者外周血中性粒细胞的 gp 91phox、白介素 (IL) 8、胞内型白介素 1受体拮抗物 (icIL 1ra)和分泌型白介素 1受体拮抗物 (sIL 1ra)基因表达进行研究。细胞吞噬和杀菌功能通过菌落计数以细胞外和胞内活菌下降的百分比表示。结果　健康对照组新鲜分离的中性粒细胞有 gp 91phox mRNA表达 ,而HD患者不表达。HD患者中性粒细胞自发表达IL 8、icIL 1ra和sIL 1ra。HD患者中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬和胞内杀菌能力均明显下降。结论　HD患者中性粒细胞表达 gp 91phox障碍 ,提示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)系统受损。粒细胞自发表达IL 8、icIL 1ra和sIL 1ra ,这种预激活状态与对金黄色葡萄球菌吞噬和杀灭作用下降相一致     

维持性血透患者外周血中性粒细胞的IL-1ra基因表达和吞噬杀菌功能

目的：对维持性血液透析（ＨＤ）患者外周血中性粒细胞（ＰＭＮ）白介素－１受体拮抗物（ＩＬ－１ｒａ）基因表达和吞噬及杀菌功能进行研究，并探讨二者的相关性。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＨＤ患者外周血ＰＭＮ ｉｃＩＬ－１ｒａ（胞内型）和ｓＩＬ－１ｒａ（分泌型）基因表达；通过菌落计数方法观察ＰＭＮ对金黄色葡萄球菌（金葡菌）吞噬和杀菌功能的改变。结果：ＨＤ患者ＰＭＮ中可检测到５１２ｂｐ（ｉｃＩＬ－１ｒａ）和１４６ｂｐ（ｓＩＬ－１ｒａ）的ＲＴ－ＰＣＲ产物；ＨＤ患者ＰＭＮ对金葡菌的吞噬和胞内杀菌能力均较正常对照明显下降（Ｐ〈０．０１或Ｐ〈０．０５）。结论：ＨＤ患者ＰＭＮ可自发表达ｉｃＩＬ－１ｒａ和ｓＩＬ－１ｒａ，这种预激活状态与其对金葡菌的吞噬和杀灭作用下降相平行。     

恶性淋巴瘤mdr1和MRP mRNA及 P-gp表达水平与化疗疗效的相关研究

目的探讨恶性淋巴瘤mdr1、MRP mRNA和P-gp表达水平与化疗疗效的相关性.方法应用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术和流式细胞术(FCM)方法,以8例人正常淋巴结为正常对照,对46例淋巴瘤患者[23例初治(HD1例,NHL22例)及23例复发(HD5例,NHL18例)]的mdr1 mRNA、MRP mRNA和P-gp表达水平与化疗疗效间的关系进行了前瞻性研究.结果复发患者mdr1基因和P-gp表达水平及阳性率均高于初治患者(P<0.001),而MRP基因表达水平及阳性率在复发与初治患者间差异无显著意义(P>0.05).mdr1基因及P-gp表达阳性患者的化疗有效(CR+PR)率(33.33%和26.67%)明显低于mdr1基因及P-gp表达阴性患者(85.71%和83.87%,P<0.001),而MRP基因表达阳性患者与阴性患者的化疗有效率差异无显著意义(P>0.05).相关分析显示,mdr1基因和P-gp表达水平之间有明显相关性(r=0.296 3,P<0.05),而mdr1和MRP之间、MRP与P-gp之间均无明显相关性(r=0.072 3,P>0.05;r=0.081 8,P>0.05).结论 mdr1基因及P-gp表达是恶性淋巴瘤患者多药耐药的主要机制,而MRP基因不是产生耐药的主要机制.mdr1基因及P-gp表达水平的高低与恶性淋巴瘤化疗疗效密切相关,而MRP基因的表达与化疗疗效未见相关.     

透析膜和内毒素对单个核细胞白细胞介素—1受体拮抗物产生的协同作用

目的：研究不同透析膜和内毒素对尿毒素对尿毒症患者外周血单个核细胞（PBMC）白细胞介素－1受体拮抗物（IL－1Ra）基因转录和IL－1Ra合成的影响。方法：细胞和不同透析膜孵育后采用细胞原位杂交检测mRNA水平,PBMC培养后采用酶联免疫吸附试验法测定细胞IL－1Ra水平。结果：不同析膜孵育后的PBMC在未用内毒素刺激情况下IL－1RamRNA水平有显著判别,但IL－1Ra合成量无差异。其中正常人仅有极微量IL－1Ra合成;内毒素刺激下的PBMC IL－1Ra合成明显明显高于未刺激组,与铜仿膜孵育后的合成量明显高于聚砜膜孵育后和对照组。结论：内毒素和透析膜对正常人和尿毒症患者PBMC的IL－1Ra的合成协同作用。     

NADPH氧化酶在人真皮成纤维细胞氧化应激损伤中的作用

目的探讨NADPH氧化酶在人真皮成纤维细胞氧化应激损伤中的作用。方法H2O2 构建氧化应激模型,将实验分为正常 组、氧化损伤组和NADPH氧化酶抑制剂（DPI）组,MTT检测细胞活力,DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）改变, Western blot分析NADPH氧化酶胞膜亚基gp91phox表达变化。结果H2O2 对成纤维细胞的氧化损伤呈时间和浓度依赖,H2O2 700 μmol/L处理24 h后细胞活力下降约40%（P<0.05）,ROS升高2倍（P<0.05）。而抑制剂组细胞活力较氧化损伤组增加20% （P<0.05）,ROS下降至正常水平（P<0.05）。Western blotting结果显示氧化损伤组gp91phox表达随H2O2 浓度逐渐升高,而抑制 剂组表达接近正常水平。结论H2O2 可通过影响NADPH氧化酶特别是胞膜亚基gp91phox引发成纤维细胞氧化损伤。     

右美托咪定对脂多糖诱导大鼠外周血中性粒细胞TREM-1mRNA表达的影响

目的：探讨右美托咪定对脂多糖（LPS）诱导大鼠外周血中性粒细胞髓样细胞触发受体‐1（TREM‐1）mRNA表达的影响。方法健康雄性Wistar大鼠40只,取外周血分离培养中性粒细胞,采用随机数字表法,将其随机分为4组（n＝10）,A组：阴性对照;B组：中性粒细胞中加入L PS （终浓度为100μg／L ）;C组：中性粒细胞中加入L PS （终浓度为100μg／L ）加右美托咪定（终浓度为0．5 ng／mL）;D组：中性粒细胞中加入LPS（终浓度为100μg／L）加右美托咪定（终浓度为1．0 ng／mL）。孵育24 h后,收集上清液,采用ELISA法测定TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度,采用RT‐PCR法测定TREM‐1 mRNA的表达。结果与A组比较,B组TREM‐1 mRNA表达上调,TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度升高,差异有统计学意义（P＜0．05）;与B组比较,C组和D组TREM‐1 mRNA表达下调,TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度降低,差异有统计学意义（P＜0．05）;与C组比较,D组 TREM‐1 mRNA表达水平、TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论右美托咪定可通过下调 TREM‐1 mRNA表达,抑制L PS诱导大鼠外周血中性粒细胞T N F‐α、IL‐1β和IL‐6的生成及分泌。     

乳酸盐与丙酮酸盐腹膜透析液对外周血中性粒细胞凋亡的影响

目的 :比较研究乳酸盐与丙酮酸盐腹膜透析 (腹透 )液对外周血中性粒细胞 (PMN)凋亡以及吞噬和杀菌能力的影响。方法 :含有不同浓度 (1.5 % ,4.2 5 % )葡萄糖的乳酸盐或丙酮酸盐腹透液 ,与外周血 PMN孵育不同时间 (10 ,30 m in)后 ,利用流式细胞术及荧光素标记的 Annexin- 检测细胞凋亡情况 ;通过菌落计数方法观察 PMN对金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )吞噬和杀菌功能的改变 ,分别以细胞外和细胞内活菌下降的百分数表示。 结果 :PMN与 1.5 %乳酸盐腹透液 (p H6 .7)孵育 10min,收集细胞 ,培养 72 h后细胞凋亡率与正常对照组比较无差异 ,而孵育时间延长至 30 min后 ,培养的 PMN在 72 h凋亡率[(6 6 .90± 2 .35 ) % ]明显增加 ,与 4.2 5 %乳酸盐腹透液 (p H7.2 ) 10 m in组结果相似 [(6 5 .36± 2 .6 0 ) % ];1.5 %葡萄糖乳酸盐腹透孵育 30 m in及 4.2 5 %葡萄糖乳酸盐腹透液孵育 10 m in组 ,PMN的吞噬及杀菌功能均较对照组显著降低。无论是含1.5 %还是 4.2 5 %葡萄糖的丙酮酸盐腹透液 ,PMN凋亡率均与对照组无显著差异 ;对 PMN吞噬和杀金葡菌功能也无显著影响。 结论 :丙酮酸盐腹透液对外周血 PMN凋亡以及吞噬和杀菌功能的影响均较小 ,具有较好的临床应用前景     

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

 目的  观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6) NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metal matrix proteinase -1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法  取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50 μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20 μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10 μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10 μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP 1、MMP 1蛋白表达。结果  UA能显著抑制瘦素诱导的gp91phox、 p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91phox、p67phox蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论  UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC T6细胞NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。     

红景天苷通过抑制NOX2-ROS-MAPKs信号途径保护H2O2诱导的PC12细胞凋亡

目的 探讨红景天苷保护H2O2诱导PC12细胞凋亡的分子机制.方法 PC12细胞置于含10％马血清、5％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基中常规培养.不同浓度的红景天苷预处理细胞2h,然后H2O2作用细胞特定的时间,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白PARP,caspase 3的表达及胞内信号分子p38,ERK和JNK的磷酸化水平;DAPI染色检测细胞核的形态改变;ROS检测试剂盒检测胞内ROS的水平;膜质分离实验检测NOX2的两个重要亚基gp91phox和p47phox在胞膜和胞质中的含量;免疫共沉淀实验检测gp91phox和p47phox的结合.结果 红景天苷浓度依赖性的抑制H2O2诱PC12细胞凋亡;减弱H2O2诱导p38,JNK和ERK的磷酸化;减少H2O2诱发的ROS释放;抑制gp91phox和p47phox的结合,进而抑制NOX2的活性.结论 红景天苷通过抑制NOX2-ROS-MAPKs信号通路保护H2O2诱导PC12细胞凋亡.     

NADPH氧化酶gp91phox与核因子-κB在子痫前期胎盘中的表达

目的 观察子痫前期患者胎盘NADPH氧化酶与NF-κB的变化,探讨二者在子痫前期的发生发展中的作用及相关性.方法 采用免疫组织化学和RT-PCR方法检测25例子痫前期患者(子痫前期组,其中轻度组15例,重度组10例)和25例正常足月孕妇(正常组)胎盘组织中的NADPH氧化酶gp91phox亚基及NF-κB p65亚基的...     

雌马酚对PC12细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制

目的探讨雌马酚对PC12细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制。方法以PC12细胞为研究对象,构建体外神经元缺氧/ 复氧损伤模型,用雌马酚进行干预。MTT法检测细胞活力,比色法测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量,免疫细胞化学法检测活性氧（ROS）含量,Western blotting 检测缺氧/复氧损伤的PC12 细胞内NADPH氧化酶2 （gp91phox）和磷酸化Src（p-Src）激酶的表达。结果雌马酚可有效减轻缺氧/复氧引起的PC12细胞损伤,降低缺氧/复氧损伤细胞培养上清液中LDH的活性和MDA的含量,明显抑制ROS的生成及gp91phox和p-Src的表达。结论雌马酚通过抑制p-Src激酶和gp91phox表达,减少ROS生成,从而对PC12细胞缺氧/复氧损伤产生保护作用。     

白细胞介素-6与肾癌细胞生长关系的实验研究

目的　研究白细胞介素 6 (IL 6 )在肾癌细胞系GRC 1中的表达及其意义。方法　运用ELISA方法检测GRC 1培养上清中IL 6的浓度 ,运用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应 (RT PCR)在翻译和转录水平上检测IL 6及其受体系统的表达 ;观察重组人IL 6和IL 6中和抗体对GRC 1生长的影响 ;用表达IL 6反义RNA的质粒转染GRC 1,观察其增殖的改变。结果　GRC 1培养上清IL 6浓度为 46 5pg/ml,RT PCR显示IL 6mRNA及IL 6受体mRNA有表达 ;在重组人IL 6和IL 6中和抗体作用下生长无明显改变 ;转染表达IL 6反义RNA的质粒以后 ,GRC 1细胞IL 6分泌下降到 2 5 0pg/ml,但生长未受抑制。结论　尽管肾癌细胞系GRC 1可以表达IL 6 ,但重组人IL 6不能促进GRC 1的增殖 ,中和抗体和反义基因不能抑制细胞增殖 ,提示IL 6可能不是GRC 1的生长因子 ;GRC 1可以表达IL 6受体系统 (IL 6R和gp130 ) ,提示IL 6的信号传导中断可能发生在受体下游。     

降钙素基因相关肽诱导人单核细胞合成趋化因子白细胞介素8的研究

目的　探讨神经肽对免疫细胞的神经免疫调节作用。方法　以人单核细胞株为体外实验模型 ,将降钙素基因相关肽 (CGRP)作用于脂多糖活化的单核细胞 ,用ELISA测定其分泌趋化因子白细胞介素 8(IL 8) ,采用逆转录多聚酶联链反应 (RT PCR)检测IL 8mRNA的表达 ,利用 4 8孔微型趋化小室分析单核细胞对中性粒细胞和淋巴细胞的趋化活性 ,并通过受体拮抗剂CGRP8 37了解CGRP对人单核细胞趋化功能的调节作用。结果　CGRP诱导活化的单核细胞分泌表达IL 8蛋白(112 0pg/ml± 15pg/ml)和IL 8mRNA增加 (IL 8/肌动蛋白比值为 1 84 5± 0 5 87) ,用受体拮抗剂CGRP8 37后IL 8减少 (6 70pg/ml± 15pg/ml) ,IL 8/肌动蛋白比值为 1 339± 0 4 34。CGRP增加活化的单核细胞对中性粒细胞和淋巴细胞的趋化活性 ,其趋化指数分别是CI =3 78± 0 0 8和CI =3 4± 0 2 7;受体拮抗剂CGRP8 37则使趋化作用减弱。结论　外周感觉神经末梢的神经肽CGRP通过受体介导 ,作用于单核细胞 ,在一定条件下诱导其合成和分泌趋化因子IL 8,促进中性粒细胞和淋巴细胞在局部炎症区域的定向迁移和集聚     

转染锌指蛋白基因A20抑制内毒素诱导的内皮细胞IL-8表达的研究

目的探讨转染外源性锌指蛋白基因A20对内毒素诱导的内皮细胞白细胞介素-8(IL-8)表达的影响.方法DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达,双抗夹心EIISA法检测内皮细胞分泌IL-8的含量变化.结果A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达;内毒素能刺激人内皮细胞分泌IL-8;A20基因能减少70%以上内毒素诱导的内皮细胞IL-8的分泌,两者间相差显著(P＜0.05).结论转染外源性A20基因能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞活化,有助于炎症的治疗.     

Normobaric hyperoxia protects the blood brain barrier through inhibiting Nox2 containing NADPH oxidase in ischemic stroke

ABSTRACT: Normobaric hyperoxia (NBO) has been shown to be neuro- and vaso-protective during ischemic stroke. However, the underlying mechanisms remain to be fully elucidated. Activation of NADPH oxidase critically contributes to ischemic brain damage via increase in ROS production. We herein tested the hypothesis that NBO protects the blood-brain barrier (BBB) via inhibiting gp91phox (or called Nox2) containing NADPH oxidase in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). Wild-type C57/BL6 mice and gp91phoxknockout mice were given NBO (95% O2) or normoxia (21% O2) during 90-min MCAO, followed by 22.5 hrs of reperfusion. BBB damage was quantified by measuring Evans blue extravasation. The protein levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), tight junction protein occludin and gp91phox were assessed with western blot. Gel zymography was used to assess the gelatinolytic activity of MMP-9. In the wild type mice, cerebral ischemia and reperfusion led to remarkable Evans blue extravasation, significantly increased gp91phox and MMP-9 levels and decreased occludin levels in the ischemic brain tissue. In gp91phox knockout mice, the changes in Evans blue extravasation, MMP-9 and occludin were at much smaller magnitudes when compared to the wild type. Importantly, NBO treatment significantly reduced the changes in all measured parameters in wild type mice, while did not cause additional reductions in these changes when gp91phox was knocked out. These results indicate that activation of Nox2 containing NADPH oxidase is implicated in the induction of MMP-9, loss of occludin and BBB disruption in ischemic stroke, and inhibition of Nox2 may be an important mechanism underlying NBO-afforded BBB protection.     

小鼠巨噬细胞α-肿瘤坏死因子基因表达的调节

The expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) mRNA in murine inflammatory peritoneal macrophages (M phi) was studied with a sensitive liquid hybridization method. Upon exposure to 10-1000 ng/ml of lipopolysaccharide (LPS), M phi were induced to express TNF-alpha mRNA in a dose-dependent manner. mRNA was detectable within 1 h after stimulation, peaked at about 2 h and then gradually declined. A 10 min treatment with LPS was enough to stimulate the maximal level of TNF-alpha mRNA, as determined in a 2 h period. Although calcium ionophore A23187 and macrophage activating factor (MAF) (both can activate M phi to mediate tumoricidal activity) did not induce TNF-alpha mRNA expression by themselves, they did act synergistically with LPS. Treatment of M phi with retinoic acid strongly inhibited LPS-induced TNF-alpha mRNA expression, whereas trifluoperazine had an opposite effect. Cycloheximide not only synergized with LPS but also induced TNF-alpha mRNA expression by itself. In contrast, actinomycin D completely blocked LPS-induced TNF-alpha gene activation. These findings indicate that LPS-induced TNF-alpha mRNA expression is not solely due to an increase in intracellular free calcium ion and is independent of the protein kinase C pathway of signal transduction. In addition, TNF gene activity may be regulated by short-lived protein repressor(s).     

兔出血性休克并腹内压升高后中性粒细胞免疫机能抑制

OBJECTIVE: To investigate the effects of hemorrhagic shock and intra-abdominal hypertension (IAH) on inflammatory responses of peripheral circulating neutrophils such as intracellular cytokine production, phagocytic capacity and expression of nuclear factor (NF)- kappaB. METHODS: Twenty-four rabbits were divided equally into 4 groups including a hemorrhagic shock (HS) group complicated by abdominal compartment syndrome (ACS) (Group A), a HS group (Group B), a ACS group (Group C) and a normal control group (Group D). Intracellular interleukin (IL)-8 production in the peripheral neutrophils were measured in the rabbits by flow cytometry, phagocytic function of the neutrophils evaluated by a chemiluminescence method and the NF-kappaB expression detected by immunocytochemistry before, immediately and 4 h after the traumatization. RESULTS: Four hours after the trauma, decreased intracellular IL-8 production and impaired phagocytic function of the peripheral neutrophils were observed in Group A along with suppressed NF-kappaB expression. But in Group B and Group C, the intracellular IL-8 production, phagocytic function and expression of NF-kappaB returned to the normal levels 4 hours after the trauma following the early-stage changes. In Group D, no significant changes occurred during the observation. CONCLUSIONS: Responsiveness and function of the neutrophils to the stimuli by endotoxin are suppressed by the sequential second-hit of IAH after hemorrhagic shock, which may contribute to the occurrence of sepsis in ACS.     

IL-12、LPS对肾小管上皮细胞中lck/P38信号传递的影响

【目的】探讨IL 12、LPS对肾小管上皮细胞中lck基因表达及活性改变的影响 ,明确lck/P3 8信号传递途径在炎症过程的作用。【方法】用原位杂交、放射自显影分别检测lck基因表达及lck活性 ,用免疫印迹法对肾小管上皮细胞在IL 12、LPS刺激下其P3 8磷酸化进行测定。【结果】肾小管上皮细胞经IL 12 ,LPS刺激后lckmRNA表达水平增高 ,lck活性在刺激后 5min时最强 ,加入lck抑制剂PP1,IL 12刺激lck活性明显减弱。IL 12及LPS可以促进肾小管上皮细胞中P3 8活化、磷酸化 ,在 15min时最强 ,加入lck抑制剂后则抑制IL 12刺激时的P3 8磷酸化 ,而LPS刺激组不明显。【结论】IL 12 ,LPS可通过促进肾小管上皮细胞中lck/P3 8活化 ,参与炎症过程。