丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。     

siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

丙型肝炎病毒全基因组培养细胞中转录调节基因的差异表达

目的利用基因芯片的高通量分析性能和丙型肝炎病毒(HCV)全基因组细胞培养系统,研究HCV对宿主细胞转录调节基因的影响和机制.方法用人工构建的HCV感染Huh-7肝癌细胞株,待其发生细胞病变后收集培养细胞,以同步培养但不感染HCV的细胞作为阴性对照.提取感染细胞和对照细胞的总RNA、总蛋白和细胞培养上清.总蛋白用于Western blotting鉴定HCV蛋白在感染细胞内的表达情况.细胞培养上清用于检测HCV在感染细胞内合成后的释放情况.总RNA 用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定抽提情况,再纯化后进行逆转录cRNA合成、荧光标记和纯化后用于基因芯片分析,检测宿主细胞转录调节基因的差异表达.结果在细胞培养上清液中可检测到HCV,感染细胞内可检测到HCV蛋白表达.基因芯片检测2倍差异表达转录调节基因发现,上调基因11个,下调基因11个.结论HCV全基因组细胞培养系统为研究HCV对感染细胞转录调节基因表达的影响提供了良好工具.利用基因芯片技术,筛选出HCV全基因组细胞培养系统中差异表达的转录调节基因,为研究HCV感染对细胞基因转录的影响提供了重要资料,加深了对HCV和宿主细胞相互作用机制的认识.     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 and telomerase activity

Objective To study the effect of hepatitis C virus nonstructural protein NS(3) （HCV NS(3)） on telomerase activity and carcinogenesis.Methods Streptavidin-peroxidase (SP) conjugated method was used to detect the expressio n of HCV NS(3) protein in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ and pRcHCNS(3)-3’. Telomerase activity was detected by an in situ telomerase a ctivity labeling method, telomeric repeat amplification protocol polymerase chai n reaction (TRAP-PCR) and telomerase PCR enzyme linked immunosorbent assay (ELI SA) technology in the transfected and non-transfected NIH3T3 cells.Results HCV NS(3) protein was expressed in the NIH3T3 cells transfected with plasmid pR cHCNS(3)-5’ expressing HCV NS(3) C-terminal deleted protein or with plasmid pR cHCNS(3)-3’ expressing HCV NS(3) N-terminal deleted protein. The positive sig nal of HCV NS(3) protein was localized in the cytoplasm of NIH3T3 cells, and th e signal intensity of the former was stronger. Telomerase activity in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ was stronger than that in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3’ (P<0.01), whereas telomerase a ctivity in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcCMV or untreated NIH3T3 ce lls was weaker than that in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3 ’ (P<0.05). The expression level of HCV NS(3) protein was significantly co rrelated with the strength of telomerase activity (P<0.05). The results ob tained by in situ telomerase activity labeling corresponded to the results by te lomerase PCR ELISA technology. Conclusions HCV NS(3) protein may activate telomerase through endogenous mechanism to induce host cell transformation. The effect of HCV NS(3) C-terminal deleted protein on telomerase activity in the host cell may be stronger than that of HCV NS(3) N -terminal deleted protein. In situ telomerase activity labeling was a reliabl e technology for studying pathological morphology and telomerase activity in tis sues and cells.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

RNA干扰GPC3基因表达影响肝癌细胞Huh-7凋亡的机制研究

目的观察RNA干扰GPC3基因表达对人肝癌细胞Huh-7凋亡的影响,并探讨其初步机制。方法设计并合成靶向GPC3的特异性siRNA片段,通过脂质体转染法瞬时转染肝癌细胞Huh-7,48h后验证siRNA的干扰效率;Annexin V/PI染色法观察GPC3基因沉默对细胞凋亡的影响;通过Western blot和定量PCR来检测caspase3的蛋白水平和核酸水平表达。结果设计合成的GPC3siRNA转染后,能够有效抑制Huh-7细胞中GPC3的表达;流式细胞仪检测结果显示,GPC3干扰组细胞在转染后48、72h的凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01),96h后两组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。GPC3干扰组的caspase3在转染后48、72h的表达高于未转染组,96h后两组间caspase3水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA静默GPC3基因能促进肝癌细胞凋亡,其机理可能与上调caspase3有关。进而推测,GPC3基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用

目的：研究RNAi(RNA interference)效应对HCV ns5b基因表达的抑制作用．方法：根据HCV ns5b基因序列及其二级结构特征，依据Tuschl等设计siRNA的原则，确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs；利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B-EGFP HepG2细胞株，以未转染的细胞为对照；细胞爬片后经DAPI染色，荧光显微镜下观察和半定量RT-PCR法检测siRNAs的抑制效应．结果：化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，效率可达70％-80％以上，结论：在细胞水平上，化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，为利用RNAi抑制HCV RNA复制的研究奠定基础。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

Potential effect of hepatitis C Virus non-structural protein 4B on liver carcinogenesis

INTRODUCTION The hepatitis C virus (HCV) is a leading causeof chronic liver disease and is estimated to in-fect over 100 million people in the world. HCV isclosely associated with the hepatocellular carcinoma(HCC) [1]. However, the carcinogenesis of HCV isnot well understood. Unlike hepatitis B virus, HCVis a RNA virus, which can integrate with the hostgenome. So abnormalities of tumor suppressor genesand oncogenes, inhibition of cell apoptosis may beinvolved with the development …     

HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析

目的在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminanthepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础。方法PCR特异扩增JFH1NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。将pET-JFH1NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1NS5A转染HEK293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Westernblot方法检测。利用PubMedBLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析。结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Westernblot检测到了GFP-JFH1NS5A融合蛋白在HEK293T细胞中表达。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%。结论JFH1NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCVNS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

HCV的新型体外细胞模型:复制子系统

自1989年丙型肝炎病毒(HCV)被分子克隆后,其流行病学、基因组学的相关研究取得了一定的进展,然而由于缺乏有效的体外细胞复制模型,HCV的研究长期以来受到阻碍. 1999年Lohmann等在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统,其被公认为是HCV RNA体外复制模型研究获得突破进展的里程碑. 复制子在人肝癌细胞株Huh-7细胞株中能高水平的自主复制. 研究发现复制子在细胞中复制对宿主细胞生长和代谢无明显影响,高水平复制与病毒基因组的适应性突变和宿主细胞的容受性有关. 这些研究结果为选择性HCV全序列基因组复制子的研究奠定了基础. 复制子系统的建立对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义.     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。