丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

Transfection of Articular Chondrocytes with rhBMP7 Gene and Its Expression

The repair of osteochondral defects remainsone of the most intensely studied orthopaedic top-ics.Nowadays the focus is on gene modified tissueengineering[1] .It is suggested that articular chon-drocytes could serve as satisfactory target cells,while bone morphogenetic protein- 7(BMP- 7) couldstimulate new bone and cartilage tissue forma-tion[2 ] .In the present study,a recombinant plas-mid pc DNA3 - rh BMP7was transduced to culturedrabbit articular chondrocytes in vitro in order toexplore …     

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的：构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株并对其构建的细胞株进行鉴定。方法：采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法，以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体，构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株；并应用Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组、载体转染组和目的基因转染组。结果：在7株转染的CHO细胞株中，有3株具有高效稳定表达的TIF3编码蛋白质；在4株转染的COS7细胞株中有2株同样具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达。结论：本研究成功地构建了3株TIF3转基因CHO细胞株和2株TIF3转基因COS7细胞株，它们对今后镉化物相关癌基因的发现及其他生物学功能的研究具有重要的应用价值。     

SUN5特异性抗体的制备及其应用

目的制备可检测全长SUN5的特异性抗体,并用该抗体检测SUN5蛋白在人类生殖细胞中的表达。方法通过生物信息 学比较SUN5与新剪切体SUN5β之间的差异,在差异区域设计合成短肽,制备SUN5多克隆抗体并纯化。用新制备的SUN5抗 体对Ntera-2细胞中的SUN5蛋白进行Western blotting和免疫荧光检测,验证抗体的特异性;最后,用该抗体对人睾丸细胞涂片 进行检测,观察SUN5 蛋白在人生殖细胞中的表达。结果成功合成了SUN5 短肽,而且用该短肽制备了SUN5 多克隆抗体。 Western blot 结果显示,新制备的SUN5特异性抗体可检测到全长SUN5蛋白。免疫荧光实验结果表明,在Ntera-2细胞中SUN5 蛋白定位在核膜和胞浆。通过对人睾丸细胞涂片的检测发现,SUN5在睾丸精母细胞、圆形精子细胞及精子中均有表达。结论 成功制备了SUN5特异性抗体,该特异性抗体的制备对于深入研究SUN5的功能具有重要的意义。此外,发现SUN5蛋白在精 母细胞、圆形精子细胞及精子中均有表达,提示SUN5蛋白可能在精子发生中发挥着重要的生理功能。     

Mithramycin A对肝癌细胞Huh-7增殖的影响

目的研究抗肿瘤抗生素光辉霉素（Mithramycin A,MIT）对人肝癌细胞Huh-7的作用。方法CCK-8比色法观察MIT对Huh-7细胞的生长抑制作用,Hoechst 33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果MIT可抑制Huh-7细胞的生长,半数抑制浓度（IC50）为60.12 nmol.L^-1。荧光显微镜观察可见细胞凋亡特征性改变;浓度为5×10^-2μmol.L^-1的MIT作用72 h后,可明显诱导Huh-7细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。结论MIT对Huh-7细胞有明显的诱导凋亡和生长抑制作用,具有浓度、时间依赖性。     

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的：探讨应用人血管内皮生长因子165 (hVEGF₁₆₅)进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法：构建pcDNA3.0-VEGF₁₆₅真核表达载体，利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况，MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果：成功构建hVEGF真核表达载体，并成功地将其转入MSCs中；MSCs细胞在转染 pcDNA3.0-VEGF₁₆₅ 质粒24、48和72 h后，其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高（P<0.05），至G418筛选后12代，转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达，含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率，与对照组比较，差异均具有显著性（P<0.05）。 结论： hVEGF₁₆₅基因成功地转染至MSCs中，并可进行有效地表达。     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。     

B7-H1慢病毒的制备及其在B16F10细胞中的表达鉴定

目的 构建小鼠B7-H1分子慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达B7-H1的B16F10细胞.方法 以小鼠B7-H1的测序质粒为模板,PCR扩增B7-H1全长,装入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将B7-H1表达载体用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染B16F10细胞后,加入含Blasticidin(终浓度为4.0 μg/ml)的RPMI1640培养基,筛选出稳定表达B7-H1蛋白的B16F10细胞株.结果 PCR扩增得到编码小鼠B7-H1的877 bp基因片段,与预期大小一致.B7-H1重组慢病毒感染B16F10细胞后,用B7-H1单抗进行免疫组化检测,荧光显微镜观察显示B7-H1分子表达于B16F10细胞.FACS测定B16F10细胞荧光阳性率为36%.结论 成功构建了B7-H1慢病毒表达载体,包装出感染性病毒颗粒,重组慢病毒感染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H1膜表面蛋白,为进一步研究B7-H1分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤免疫逃逸机制中的作用奠定了基础.     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

HER2基因的克隆及其在MCF-7细胞中的表达

目的克隆人表皮生长因子受体（HER2）基因,建立共表达HER2基因和雌激素受体（ER）基因的MCF-7细胞模型.方法从高表达HER2的人乳腺癌细胞株SKBR-3中,用RT-PCR技术克隆HER2基因全长cDNA,将其插入载体pcDNA3.1中构建重组真核表达载体pcDNA3.1-HER2.测序鉴定后,利用阳离子脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用免疫细胞化学、流式细胞术及Western blotting等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况.结果DNA测序证明,获得的HER2基因序列与GenBank中报道序列完全一致.将其转染MCF-7细胞,经流式细胞术、Western blotting及免疫细胞化学等方法检测证实,转染细胞内有HER2基因高表达.结论成功克隆HER2基因并获得共表达HER2基因和ER基因的MCF-7细胞株.     

人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的：构建并制备含人B7-1基因的重组腺病毒（Ad-B7-1)载体,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法：应用逆转录-套式PCR方法从人骨髓细胞中克隆B7-1的cDNA后,将其克隆至小片段腺病毒载体pCI′中,后与pHBG10在293细胞内重组包装产生腺病毒,感染SGC7901细胞。结果：成功克隆了人B7-1的cDNA并构建Ad-B7-1载体,且经过酶切鉴定和测序验证,感染Ad-B7-1的细胞经PCR鉴定,表明B7-1基因已整合入细胞基因组。结论：本实验构建的腺病毒载体可有效地转B7-1基因进入肿瘤细胞,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。     

pCDNA3.1-Annexin A7载体的构建及在Hca-p细胞中的表达

[目的]构建pCDNA3.1-Annexin A7载体并稳定转染Hca-p细胞。[方法]提取小鼠总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增,获取Annexin A7 CDS,将PcDNA3.1（＋）质粒和Annexin A7 CDS片段行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,构建并抽提pCDNA3.1-Annexin A7质粒,测序鉴定后转染Hca-p细胞,经400μg/mL G418完全培养基筛选获得pCDNA3.1-Annexin A7载体稳定转染的Hca-p细胞,在蛋白质水平检验Annexin A7的表达并行基因组DNA鉴定。[结果]成功构建pCDNA3.1-Annexin A7载体,经测序鉴定,所得到的载体中的CDS经比对与库中序列一致。pCDNA3.1-Annexin A7载体转染Hca-p细胞后,获得稳定上调表达Annexin A7的Hca-p细胞株;行基因组DNA鉴定,证实pCDNA3.1-Annexin A7已转入Hca-P细胞中,western-blotting结果显示转染前后蛋白的表达相对值Annexin A7/GAPDH分别为0.43544&#177;0.0112和0.45957&#177;0.0065（P〈0.05）。[结论]pCDNA3.1-Annexin A7的构建并稳定转染Hca-p细胞成功,为通过上调Annexin A7在Hca-P的表达以证实Annexin A7与恶性肿瘤淋巴道转移潜能关系的相关研究打下了基础。     

Construction of Porcine CCK pDNA and Its Expression in COS-7 Cells

CCK correlates with the generation and progression of pancreatic cancer. The research aims to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP/CCK (CCK pDNA) and transiently express it in COS-7 cells. Total RNA was extracted from porcine intestinal mucosa. RT-PCR was used to amplify the aimed segments CCKcDNA which was then digested with EcoR1 and BamH1 and inserted into a eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP to construct CCK pDNA. The con- structed plasmid was transfected into COS-7 cells by lepofectamineTM2000-mediated transfer method. The expression of CCK in transfected COS-7 cells was detected 24, 48 and 72 h post-transfection with fluorescence microscopy and the expression level of CCK mRNA in transfected COS-7 cells was assayed by using RT-PCR. The results showed CCK pDNA was successfully constructed and expressed transiently in COS-7 cells. Green fluorescent protein could be detected in the COS-7 cells transfected with porcine CCK pDNA 24 h post-transfection. At 48th h post-transfection, the number of positive cells was increased significantly and much brighter green fluorescence could be detected. And 72 h post-transfection, the green fluorescence of positive cells became even stronger, while no green fluorescence was detected in the control group. The expression of CCK mRNA in the cells was detectable by using RT-PCR. In COS-7 cells transfected with CCK pDNA a high level of porcine CCK mRNA was detected while no expression of porcine CCKmRNA was found in the cells trans- fected with null plasmid. It was concluded CCK pDNA was expressed successfully in COS-7 cells, which lays a foundation for further research on the relationship between CCK and tumor.     

ICOS/Fc在CHO细胞中的稳定表达

目的:探讨Picos/Fc融合蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的稳定表达及其表达产物的纯化和初步鉴定,为其功能研究和临床应用奠定基础.方法:将Picos/Fc表达质粒及含G418抗性基因neor的质粒Pegfp共转染CHO细胞,经G418抗性培养基筛选、克隆化培养、夹心ELISA检测,挑选100%强阳性且表达均一的细胞克隆,扩大培养取上清经Protein A亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western印迹等进行分子质量、纯度、抗原特异性的初步鉴定.结果:获得稳定表达ICOS/Fc蛋白的CHO细胞单克隆,制备并经Protein A亲和层析柱获得纯化的ICOS/Fc融合蛋白,SDS-PAGE胶可见一条Mr约70×103的与预期分子质量大小相符的蛋白条带,Western印迹法可在同一位置检测到该蛋白与HRP酶标抗人Fc mAb特异结合.结论:在CHO细胞中成功地建立了稳定表达ICOS/Fc融合蛋白的细胞系,表达并纯化了有抗原特异性的重组ICOS/Fc融合蛋白.     

人结直肠癌组织中B7和ICOS分子mRNA的表达

目的:通过原位检测B7-1,B7H1,B7H2和ICOS等分子mRNA在结直肠癌细胞及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的表达,以期探讨肿瘤微环境中Th2型细胞因子表达上调的可能机制.方法:采用原位杂交技术,用地高辛标记的寡核苷酸探针检测了22例人结直肠癌组织B7-1,B7H1,B7H2和ICOS分子mRNA表达状况,并结合临床特点加以综合分析.结果:肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞除表达B7-1外,均可见B7H1,B7H2 和ICOS mRNA表达,但肿瘤细胞的表达水平显著高于TIL的表达水平,具有显著性差异(P<0.05);B7家族分子在癌细胞和TIL中的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无区域淋巴结转移无关,在TIL中B7H1表达与肿瘤浸润深度有关(P<0.05);在癌细胞中则与之无关(P=0.155);在癌细胞和TIL中B7H1和ICOS分子表达与远处转移之间具有显著性差异(P均<0.01).结论:肿瘤细胞和TIL表达B7H1,B7H2和ICOS分子可能与肿瘤微环境中Th2型细胞因子占优势有关.