携带CML28基因的2型重组腺相关病毒的构建及体外转染树突状细胞

 目的 构建携带肿瘤抗原CML28基因的2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV2/CML28）,检测其体外转染人树突状细胞（dendritic cells,DCs）后对DCs的影响和目的基因CML28的表达。方法 将CML28基因克隆到2型重组腺相关病毒载体系统（AAV Helper-Free System）中的真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP,将酶切和DNA测序鉴定后的重组表达质粒pAAV-CML28-hrGFP与AAV Helper-Free System 中的病毒包装辅助质粒pAAV-RC和pHelper以磷酸钙法共转染AAV-293细胞,制备携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28。rAAV2/CML28转染体外培养的DCs,RT-PCR法检测CML28的表达,流式细胞术检测DCs的表面分子和rAAV2/CML28转染DCs的效率。结果 流式细胞术证实构建并包装了rAAV2/CML28,该病毒对DCs的转染效率接近30%,病毒转染DCs检测到CML28的表达以及高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表达。结论 成功构建了携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28,该病毒介导目的基因在DCs内表达,DCs的成熟没有因病毒转染受到不良影响,为应用CML28转基因DCs诱导CML28特异性抗肿瘤免疫研究奠定了基础。     

携带不同 HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞诱导CTL的效应研究

目的：了解携带不同HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒（rAAV‐HBV‐S、C、E、X）转染慢性乙型肝炎患者来源的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应。方法采用携带不同HBV抗原基因片段的rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染慢性乙型肝炎患者外周血中分离出的单核细胞,并在GM‐CSF、IL‐4和TNF‐α作用下继续培养7 d获得成熟的DC。通过观察DC的状态和流式细胞仪（FACS）检测各段 HBV转染后DC分化抗原（CD）的表达,评价其成熟与功能。将同一个体的DC与T细胞混合培养制备CTL ,通过四甲基偶氮唑盐（MTS）细胞杀伤实验研究被激活的CTL对HBV感染的靶细胞HepG2．2．15特异性的细胞毒作用。结果不同 HBV 抗原基因 rAAV‐HBV‐S、C、E、X 转染DC后 CD14、CD80、CD83、CD86的表型表达中, CD80、CD83差异有统计学意义（P＜0．05）;rAAV／HBV‐X转染的DC其CD80表达最高,rAAV／HBV‐S转染的DC其CD83表达最高。转染不同 HBV 抗原基因片段 rAAV（S、C、E、X）的 DC 诱导的 CTL 对 MHC‐Ⅰ类抗原阳性且有 HBV 的靶细胞（HepG2．2．15）的特异性杀伤效率显著高于对无 HBV的靶细胞（HepG2）的非特异性杀伤效应（P＜0．01）,但不同rAAV‐HBV组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染DC均可诱导CTL引起M HC‐Ⅰ依赖的特异性细胞毒效应。     

淋巴细胞趋化因子基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞的 …

目的 通过选择性增强树突状细胞（ＤＣ）与Ｔ细胞的体内相互作用。优化其体内抗原提呈的微环境,为进一步增强ＤＣ介导的肿瘤免疫治疗效果。方法 体外培养的小鼠骨髓树突太细胞体外经Ｌｔｎ重组腺病毒感染后（Ｌｔｎ－ＤＣ）,用３ＬＬＬｅｉｗｓ肺癌细胞株的Ｍｕｔｌ抗原肽冲击致敏,按不同剂量免疫正常同系小鼠体内,观察其体内诱导的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性保护性免疫反应。通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

Chemoprotection of transfer of multidrug resistance gene into human hematopoietic progenitor cell

Ｍｏｓｔｏｆｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃｍａｌｉｇｎａｎｃｅｓａｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔｈｅｍａｉｎｄｏｓｅ ｒｅｌａｔｅｄｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｍａｎｙｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｒｕｇｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｔｈｉｓｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｕｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎａｌｓｕｐｐｏｒｔ,ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ,ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｃｕｅ ,ａ…     

NOD小鼠CD8α+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的：构建NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞（DCs）中的表达,阐明1型糖尿病（T1DM）的发病机理。方法：设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α⁺基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α⁺基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α⁺蛋白的表达。结果：成功构建了NOD小鼠CD8α⁺抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论：NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。
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Effects of CTLA4-Ig Gene-modified Dendritic Cells on the Corneal Allografts

The success of corneal transplantationis most a-mongtransplant operation,but thei mmunorejectionisthe pri mary reasonfor the failure of corneal transplan-tation currently.Decreasing the i mmunologic rejectionis helpful to advance the success rate of the operation.Dendritic cells(DCs)are the most i mportant antigenpresenting cells(APC)[1]and have double functions inthei mmunity system.Langerhans cells(LC)are theDCs on the corneal epithelium.Recent studies indica-tedthat LCplayi mportant ro…     

In Vitro Anti-tumor Immune Response Induced by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Carrying Mutant K-ras Genes

Summary： The specific anti-tumor immune response induced by mouse bone marrow dendritic cells （DCs） lransfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes was investighted. DCs were generated from mouse bone marrow in the presence of rmGM-CSF （3.3 ng/mL） and rmIL-4 （1.3 ng/mL） and detected by FACS, and then transfecled with the recombinant adenovirus encoding mutant k ras gene. The efficacy of transfection and T cell stimulating activity of DCs were detected. CTL activity of the mice vaccinated with DCs was observed. The resuhs showed thai DCs had dendritic veiled morphology. BmDCs highly expressed B7-1（80%）, B7-2（77%）, MHC Ⅱ （70%）, CDllc （65%）, CD40 （70%） and CD54 （96%） with FACS, and no significant difference in the expression was observed before and after the transfection （P〈0.05）. The DCs transfeeled by mutant k-ras gene could significantly stimulate lymphoeytes proliferation as compared with those transfeeted by Ad e or non-modified DCs （P〈0.05）. DC vaccine transfected by mutant k-ras gene could induce CTL activity against Lewis lung cancer, but not against B16. The specific eytotoxicity against Lewis lung cancer in Ad-k-ras/12-transdueed DC group was signifieantly higher than those in the control, vector and non transfeeted DCs groups （P〈0.05）. It was concluded that special antitumor response could be induced by DCs transfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes.     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。     

Her2/neu基因重组腺相关病毒转染人外周血来源树突状细胞的免疫功能

目的 Her2/neu基因重组腺相关病毒(rAAV-Her2/neu)转染人外周血树突状细胞(DC),并检测其免疫功能。方法 采用Ficoll分离健康人外周血中的单个核细胞。将其分成两组,给其中一组加入病毒。应用含10%人AB血清的RPMI-1640培养基及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介-4、肿瘤坏死因子-α培养。第7天收获成熟DC。流式细胞仪检测DC表型。³H-TdR检测同种混合淋巴细胞反应。MTT法检测DC诱导T细胞的杀伤活性。结果 加病毒组CD1a、CD86和CD83分别为:98.10%、99.42%、84.59%;无病毒组为:92.69%、98.07%、82.72%,组差别不明显。加病毒组CD40、CD80分别为:61.02%、97.61%;无病毒组为:36.19%、55.5%,加病毒组高于无病毒组。两组均能刺激T淋巴细胞增殖。加病毒组DC可诱导特异性杀伤,最高杀伤率(39.7±7.2)%。结论 rAAV-Her2/neu转染的DC有更强的免疫功能。     

双基因导入人脐血CD34^＋细胞共表达的调控

目的 观察携带双基因的逆转录病毒载体转导人脐血ＣＤ３４＾＋细胞后,猴病毒４０（ＳＶ４０）早启动子和内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）对载体上,下游双基因共表达的影响。方法 分别构建含ＳＶ４０早启动子和ＩＲＥＳ的双基因逆转录病毒载体ｐＬＥＳＮ和ｐＬＥＩＮ,两者均携带增强型绿色荧光蛋白和新霉素抗性ｎｅｏ基因。重组载体经包装以其病毒上清感染经磁性细胞分离仪富集的人脐血ＣＤ３４＾＋细胞,而后进行集落形成细胞测     

Her2/neu基因重组腺相关病毒转染人外周血来源树突状细胞的免疫功能

OBJECTIVE: To observe the immunostimulatory effect of human peripheral blood dendritic cells (DCs) transfected by Her2/neu gene delivered by adeno-associated virus. METHODS: The mononuclear cells in healthy donors were isolated by Ficol-Hypaque density gradient separation and divided into transfection group and control group without transfection by the recombinant virus. The cells were initially cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% AB human serum, followed by addition of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin (IL)-4 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha into the medium. The surface markers of DC were detected by flow cytometry, allogeneic mixed lymphocyte reaction assayed by 3H-TdR incorporation and the specific killing activity of T cells evaluated by MTT assay. RESULTS: The expression rates of CD1a, CD86 and CD83 of the transfected DCs were 98.10%, 99.42%, and 84.59%, and those of the non-transfected DCs were 92.69%, 98.07%, and 82.72%, respectively, showing no obvious differences between the two groups. The rates of CD4 and CD80 expression were 61.02% and 97.61%, respectively, in the transfected DCs, significantly higher than those in the non-transfected cells (36.19% and 55.5%). Both groups of DCs stimulated a strong T cell proferation response. The transfected DCs were capable of inducing specific killing of the target tumor cells, with the highest killing rate of (39.7+/-7.2)%. CONCLUSION: The immunostimulatory effect of human peripheral blood DCs can be enhanced by Her2/neu gene transfection mediated by adeno-associated virus.     

β—地中海贫血基因治疗研究：I.以逆转录病毒作载体将人...

We used a replication-defective retrovirus vector containing the human beta-globin gene to transfect the ecotropic packaging cell line psi-2, and then harvested the virus supernatant to infect the amphotropic packaging cell line PA317. As a result, a recombinant vector producing cell line (PIW beta) with a titer of 1.1 x 10(5) CFU/ml was isolated. By infecting Friend cells with this high titer virus vector, high efficiency gene transfer was achieved. Southern blot hybridization analysis indicated that the intact human beta-globin gene was stably integrated into the genome of the target cells. Our results provide a useful reference for further studies of gene therapy of beta-thalassemia.     

HIF—la asODN转染的树突状细胞对胶质瘤细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1a（HIF-1a）反义寡核苷酸（asODN）转染的树突状细胞（DC）与U251胶质瘤细胞融合后的抗胶质瘤活性。方法将HIF-1a asODN利用脂质体包裹转染DC,采用PEG化学融合方法将DC与U251胶质瘤细胞融合,通过MTT法及流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率。结果HIF-1a asODN转染DC组与各对照组相比细胞增殖下降,凋亡增加（P〈0．01）。结论HIF-1a asODN转染DC后,再与U251胶质瘤细胞融合能够比单纯使用HIF-1a asODN转染U251细胞或单纯使用DC细胞取得更好的抑制胶质瘤细胞生长及促进其凋亡的效果。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^＋细胞

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34^ 细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞，免疫磁性分离仪纯化CD34^ 细胞，重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞，并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32．8％，CD34^ 细胞的基因转导效率最高为25％．在所观察的时间内，转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34^ 细胞，绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因，为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增殖的抑制作用

目的　探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) / 5 -氟胞嘧啶 (5 - FC)系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法　将含 CD基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体内外药物敏感实验 ,包括 :(1)计算转化细胞在前体药物 5 - FC作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率 ;(2 )MTT法检测旁观者效应 ;(3)观察 5 - FC对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果　转化细胞在 5 - FC作用下其生长抑制率为 80 .0 % ,克隆形成抑制率为 79.0 % ,均明显高于未转化细胞生长抑制率 4.8%和克隆形成抑制率5 .0 % (P<0 .0 1) ;混合细胞中含 10 %的转化细胞时 ,生长抑制率已达 5 0 .7% ;转化细胞的裸鼠移植瘤在 5 - FC作用下体积缩小。结论　 CD/ 5 - FC系统对人胰腺癌细胞系细胞具有实验性基因治疗作用     

融合快速培养的树突细胞体外诱导特异性抗肝癌免疫反应

目的用培养健康志愿者外周血CD14+单核细胞获得的成熟树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3细胞构建融合细胞,在体外观察和评价这类融合细胞的功能。方法从HLA-A2阳性的健康人外周血中分离出CD14+细胞,在树突细胞完全培养基中经过48h培养及促成熟获得成熟的树突细胞(称之为FastDC)。以50%聚乙二醇和10%二甲基亚砜为融合剂融合树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3细胞,细胞融合成功后进行融合细胞刺激自体T细胞增殖及CD8+T细胞特异性杀伤实验,并与树突细胞组、HCCLM3组及树突细胞和HCCLM3混合组进行比较。结果用48h培养获得的树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3细胞所构建的融合细胞能有效刺激自体T细胞的增殖反应,所活化的CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平(3d为400pg/ml±60pg/ml,5d为1030pg/ml±160pg/ml,7d为1260pg/L±180pg/L)高于其他组,而且能以MHC-Ⅰ类分子途径特异性杀伤HCCLM3细胞。结论从外周血CD14+细胞48h培养所获树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3细胞构建的融合细胞体外能有效诱导特异性杀伤HCCLM3细胞的免疫反应。     

两种抗原致敏方式负载树突状细胞疫苗对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的 比较两种抗原负载方式对树突状细胞(DCs)疫苗的影响.方法 抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养.通过反复冻融LoVo细胞,提取肿瘤细胞裂解物或者使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DCs,诱导特异性细胞毒性T细胞.检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测两组CTL对LoVo细胞的杀伤作用.结果 两种方式均可培养的成熟DCs,诱导的CTL细胞分泌IFN-γ有所增加;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LoVo细胞,腺相关病毒提呈抗原制备的DCs疫苗对LoVo细胞的杀伤作用明显高于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.结论 两种抗原提呈方式均可培养出成熟的DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,并可诱导自体CTL增殖.使用腺相关病毒转染DCs的方式明显优于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.